曝氣生物濾池生物膜胞外聚合物提取方法對比研究

顧超超， 郭彥海， 孫許超， 劉振鴻， 1b， 薛 罡， 1b， 賈漢忠， 高 品， 1b

(1.東華大學a. 環境科學與工程學院；b. 國家環境保護紡織工業污染防治工程技術中心， 上海 201620；2.中國科學院 新疆理化技術研究所， 新疆 烏魯木齊 830011)

曝氣生物濾池生物膜胞外聚合物提取方法對比研究

顧超超1a， 郭彥海1a， 孫許超1a， 劉振鴻1a， 1b， 薛 罡1a， 1b， 賈漢忠2， 高 品1a， 1b

(1.東華大學a. 環境科學與工程學院；b. 國家環境保護紡織工業污染防治工程技術中心， 上海 201620；2.中國科學院 新疆理化技術研究所， 新疆 烏魯木齊 830011)

以曝氣生物濾池生物膜作為研究對象，采用去離子水作為提取液，對比考察了8種方法對生物膜胞外聚合物(extracellular polymeric substances， EPS)提取效率及其組分含量的影響，同時利用紫外可見光(UV-vis)光譜分析不同方法在EPS提取過程中對細胞的破壞程度，確定生物膜EPS提取的最佳方法.結果表明，熱提法(60 ℃)對生物膜緊密結合型胞外聚合物(TB-EPS)提取效率最高，提取量可達132.0 mg/g，且對細胞破壞程度最輕，DNA含量約占TB-EPS總量的7.0%，表明熱提法是生物膜EPS提取的有效方法.

曝氣生物濾池； 生物膜； 胞外聚合物； 熱提法； 紫外可見光光譜

生物膜胞外聚合物(extracellular polymeric substances， EPS)是一種具有三維網狀結構，呈凝膠態的大分子含水基質[1]，主要由多糖和蛋白質構成，同時還含有少量核酸和脂類物質[2-4].由于其自身特殊的結構特征和物化性質，能夠有效地將微生物細胞緊密結合，增強對外部不利環境的抵抗能力，在水處理微生物的團聚和穩定過程中發揮著重要作用.

根據EPS和微生物細胞表面的結合程度，通常可將EPS分為溶解型(S-EPS)和結合型(B-EPS)兩類，而B-EPS又可進一步分為松散結合型(LB-EPS)和緊密結合型(TB-EPS).S-EPS與細胞之間結合力很弱，易溶于水相中，采用離心方法即可分離[5]，因此已報道的關于微生物EPS提取的研究主要集中于B-EPS，包括物理法(如熱提法和超聲法等)和化學法(如乙二胺四乙酸(EDTA)法和NaOH法等)兩大類[6-11].考慮到不同方法在EPS提取過程中對微生物細胞的作用各不相同，因而對EPS提取效率和各組分含量會產生較大影響.由于不同水處理微生物絮體結構組成和功能形態之間差異較大，目前還尚未形成一種通用的EPS標準提取方法.

本文以長期穩定運行的曝氣生物濾池(BAF)生物膜作為研究對象，采用熱提法(60 ℃)、陽離子交換樹脂法(CER)、超聲法、EDTA法、NaOH法、H2SO4法、熱堿法和甲醛+NaOH法共8種方法進行EPS提取的對比分析，并以高速離心法作為空白對照，以確定最佳提取方法，同時利用紫外可見光(UV-vis)光譜手段分析不同方法在EPS提取過程中對細胞的破壞程度，確保其不僅具有較高的EPS提取效率，且對細胞的破裂影響較輕.

1 材料與方法

1.1 分析儀器及化學試劑

分析儀器：S220型臺式pH計(Mettler Toledo)、 SG9型溶解氧儀(Mettler Toledo)、 Vortex-Genie2型渦旋振蕩器(Scientific Industries)、 Heraeus X1R型臺式高速離心機(Thermo Scientific)、 KQ-250DB型超聲波清洗器(寧波新芝生物科技股份有限公司)、TU-1810型紫外可見光分光光度計(北京普析通用儀器有限責任公司)、JY88-IIN型超聲破碎儀(寧波新芝生物科技股份有限公司)、SPH-2102C型恒溫搖床(上海世平實驗設備有限公司).

化學試劑：除小牛胸腺DNA(純度為98%)購自美國Sigma-Aldrich公司外，其他化學試劑均為分析純，購自國藥集團化學試劑有限公司.

1.2 生物膜來源

本研究生物膜取自實驗室長期穩定運行的BAF.BAF柱高為1 200 mm，內徑為80 mm，填料為陶粒，裝填高度為900 mm，裝填密度為1.65 g/cm3. BAF處理原水為人工配水，主要水質參數如下：CODCr為180～200 mg/L，氨氮為10～15 mg/L， pH值為7.0±0.2，溶解氧(DO)為2.0～4.0 mg/L，溫度為(20±5) ℃.

生物膜提取：從BAF中間部位采集一定質量載有生物膜的陶粒，漩渦振蕩30 s，將生物膜從陶粒表面剝離溶于去離子水中，勻漿預處理后進行后續EPS的提取和組分分析.勻漿溶液pH值約為7.0，固體懸浮物(SS)為2.65 mg/L.

1.3 生物膜樣品預處理及EPS提取方法

1.3.1 EPS提取液的選擇確定

為考察不同提取液對生物膜EPS提取效果的影響，本文分別使用去離子水[12]、 0.9% NaCl溶液[13]和緩沖溶液[10， 14](2 mmol/L Na3PO4、 4 mmol/L NaH2PO4、 9 mmol/L NaCl和1 mmol/L KCl 的混合溶液，pH值=7.0)作為提取液進行試驗，步驟如下：

(1) 各取50 mL生物膜溶液，超聲預處理5 min以獲得均質溶液，然后在4 ℃和2 000 r/min下離心20 min，收集上清液，經0.45 μm濾膜過濾，即得S-EPS；

(2) 在步驟(1)離心所得生物膜固體中加入提取液定容至50 mL，在150 r/min下恒溫振蕩1 h，然后在4 ℃和4 000 r/min下離心20 min，收集上清液，經0.45 μm濾膜過濾，即得LB-EPS；

(3) 在步驟(2)離心所得生物膜固體中再次加入提取液定容至50 mL，在60 ℃下水浴加熱1 h，然后在4 ℃和9 000 r/min下離心20 min，收集上清液，經0.45 μm濾膜過濾，即得TB-EPS.

1.3.2 EPS提取方法

本文先將生物膜溶液按照上述步驟(1)和(2)進行S-EPS和LB-EPS分離，然后分別采用8種不同的方法對TB-EPS進行提取，提取過程及條件參數如圖1所示.

8種方法對TB-EPS提取的具體過程如下：

(1) 熱提法：在60 ℃下水浴1 h.

(2) CER法：在生物膜溶液中按陽離子樹脂(001×7 Na+型，20～50目，國藥集團化學試劑有限公司)與揮發性懸浮固體物(VSS)質量比例為50：1加入樹脂，置于搖床中，在4 ℃和150 r/min下振蕩1 h.

圖1 生物膜EPS提取方法流程Fig.1 Procedures used for biofilm EPS extraction

(3) 超聲法：采用超聲細胞破碎儀，在20 kHz和120 W下，冰浴超聲破碎10 min，然后置于搖床中，在4 ℃和150 r/min下振蕩1 h.

(4) EDTA法：加入等體積的質量分數為2%的EDTA溶液，混勻后置于搖床中，在4 ℃和150 r/min下振蕩1 h.

(5) NaOH法：加入等體積的濃度為1 mol/L的 NaOH溶液，調節pH值=11，混勻后置于搖床中，在4 ℃和150 r/min下振蕩1 h.

(6) H2SO4法：加入等體積的質量分數為8%的H2SO4溶液，混勻后置于搖床中，在4 ℃和150 r/min下振蕩1 h.

(7) 熱堿法：加入濃度為1 mol/L的NaOH溶液，調節pH值=11，混勻后在80 ℃下水浴1 h.

(8) 甲醛+NaOH法：先加入0.12 mL質量分數為36.5%的甲醛溶液，混勻后置于搖床中，在4 ℃和150 r/min下振蕩30 min，再加入50 mL濃度為1 mol/L 的NaOH溶液，再恒溫振蕩30 min.

采用高速離心法作為空白對照，將S-EPS和LB-EPS提取后所得的生物膜固體在4 ℃和9 000 r/min下離心20 min，上清液經0.45 μm濾膜過濾后獲得TB-EPS.

1.4 檢測分析方法

生物膜EPS提取量以單位質量VSS所含的多糖、蛋白質及核酸3者質量之和進行表征，單位為mg/g.其中，多糖含量采用硫酸蒽酮法[15]進行測定，以葡萄糖作為標準物質；蛋白質含量采用Folin- 酚試劑法[16]進行測定，以牛血清蛋白為標準物質；核酸含量采用二苯胺顯色法[17]進行測定，以小牛胸腺DNA作為標準物質.采用UV-vis光譜對8種方法所提取的TB-EPS進行掃描，波長范圍為200～700 nm， 同時以DNA含量評價不同提取方法對細胞的破壞程度[18].生物膜SS和VSS參照國家標準監測分析方法測定[19].

2 結果與討論

2.1 不同提取液對生物膜EPS及其組分含量的影響

本文分別采用去離子水、NaCl溶液和緩沖溶液作為提取液，考察分析不同提取液對生物膜EPS及各組分含量提取效果的差異，同時以DNA含量作為細胞破裂程度的判別指標，評價不同提取液對生物膜EPS的提取效果及適用性，試驗結果如圖2所示.

圖2 不同提取液對生物膜EPS及其組分含量的影響Fig.2 Effect of different extraction solution on the content and component of biofilm EPS

由圖2可以看出，不同提取液對生物膜EPS及其組分含量的提取效果差別較大.當采用緩沖溶液時，EPS提取量可達242.7 mg/g，而采用去離子水和NaCl溶液所提取的EPS總量分別為208.3和173.9 mg/g.從EPS組分含量分析可知，去離子水、NaCl溶液和緩沖溶液對多糖的提取效果類似，多糖提取量分別為118.6、 107.2和126.7 mg/g.相比之下，采用NaCl溶液對蛋白質的提取效果(43.2 mg/g) 要明顯低于去離子水和緩沖溶液(均約為75.8 mg/g).

此外，不同提取液對生物膜EPS中DNA含量的影響差別也較大.由圖2可知，采用去離子水、NaCl溶液和緩沖溶液所提取的EPS中DNA含量分別為13.9、 23.5和40.1 mg/g，占EPS總量的6.7%、 13.5%和16.5%.盡管NaCl溶液和緩沖溶液對細菌細胞具有一定保護作用[10， 14]，但生物膜成分組成復雜，且NaCl溶液和緩沖溶液中所含有的Na+和K+可與細菌體和EPS之間的鍵合陽離子發生置換，從而削弱EPS與細菌細胞之間的結合力，造成一定程度的細胞裂解[20].通過比較分析可知，采用緩沖溶液作為提取液，所引起的細胞破裂程度最大，導致胞內物質大量釋放.相比之下，采用去離子水作為提取液，不但對生物膜EPS提取效果較好，而且所引起的細胞破裂程度最小，因此，后續研究均采用去離子水作為提取液.

2.2 不同提取方法對生物膜TB-EPS及其組分含量的影響

不同提取方法對生物膜TB-EPS及其各組分含量的提取效果如圖3所示.由圖3可以看出，不同提取方法對生物膜TB-EPS提取效率差別較大，且各組分含量差異也較為明顯.由于高速離心法的提取條件較為溫和，主要依靠剪切力強制將TB-EPS從細胞表面剝離下來，從而達到分離TB-EPS的目的，通常作為空白對照來評價不同方法對TB-EPS的提取效果.該方法所提取的TB-EPS總量和DNA含量較低，分別為23.3和3.7 mg/g.

圖3 不同提取方法對生物膜TB-EPS及其組分含量的影響Fig.3 Effect of different extraction methods on the content and component of biofilm TB-EPS

通過對生物膜TB-EPS總量對比分析可知，熱提法對TB-EPS提取效率最高，總量可達132.0 mg/g， 遠高于文獻[7]的提取效果.此外，TB-EPS中DNA含量較低，約為9.2 mg/g，占TB-EPS 提取總量的7.0%.熱提法通過加熱增大生物膜TB-EPS組分的分離擴散速率，從而增大其溶解度，達到分離提取的目的[21].文獻[22]的研究表明，生物膜TB-EPS提取總量會隨著溫度的升高而有所增加，主要是因為多糖和核酸分子結構熱穩定性相對較好.然而，過高的提取溫度不僅會導致TB-EPS中蛋白質變性，而且會嚴重破壞細胞結構的完整性，造成胞內物質溶出，從而干擾TB-EPS的準確測定.本文研究結果同樣表明，60 ℃水浴熱提法對生物膜TB-EPS提取效果較好.

EDTA是一種提取TB-EPS的有效方法[23].由于TB-EPS中蛋白質、多糖和核酸分子間一般通過Ca2+和Mg2+等二價金屬離子進行橋接，EDTA的加入能夠與這些金屬離子發生螯合作用，從而削弱TB-EPS與細胞之間的結合作用，導致TB-EPS的釋放和溶解[24].由圖3可知，EDTA對生物膜TB-EPS的提取效率僅次于熱提法，總量約為65.8 mg/g，但其中DNA含量較高，達18.6 mg/g，由此表明EDTA對微生物細胞的破壞程度較大.研究表明，EDTA對EPS的提取效率與其濃度密切相關[25]，但過高濃度的EDTA對細胞破壞程度也越大[26].

CER法提取生物膜中TB-EPS的過程機理主要包括以下兩個方面[20]：一是物理作用，通過CER顆粒與生物膜之間的相互磨擦和擠壓，將TB-EPS從細胞表面脫落下來；二是化學作用，CER可將生物膜TB-EPS基質網狀結構中的二價陽離子置換出來，削弱TB-EPS與細胞之間的結合力，從而導致TB-EPS的分離釋放.由圖3可知，采用CER法所提取的TB-EPS含量約為54.1 mg/g，僅次于熱提法和EDTA法，這與其他研究人員的前期結果[4， 27]相類似.此外，TB-EPS中DNA含量約為11.2 mg/g，低于文獻[28]中采用CER法對活性污泥TB-EPS的提取效果(16～24 mg/g)，但略高于本研究熱提法的提取效果.

超聲法是利用超聲波產生的剪切力，在細胞表面形成壓力沖擊，影響TB-EPS與細胞之間的結合力，從而使TB-EPS從細胞表面剝離[29].本文采用超聲法所提取的生物膜TB-EPS含量約為45.7 mg/g，低于上述熱提法、EDTA法和CER法的提取效率，但遠高于文獻[26]對污泥中TB-EPS的提取效果.與此同時，TB-EPS中DNA含量為10.2 mg/g，約占TB-EPS總量的22.3%，表明細胞破裂程度較為嚴重，這可能與超聲功率較高有關.

NaOH和H2SO4法主要是通過改變體系pH值影響生物絮體表面電荷的電性，增大TB-EPS與細胞表面之間的排斥力，從而使得TB-EPS剝離細胞表面而溶于水相中[25].在本文中，NaOH和H2SO4法對生物膜TB-EPS的提取量分別約為45.6 和42.0 mg/g，但其中DNA含量高達18.9和21.3 mg/g，占TB-EPS總量的44.4%和55.0%，表明細胞破裂程度非常嚴重.類似地，熱堿法同樣是采用NaOH作為提取劑，且加熱提取體系溫度至80 ℃，結果顯示，所提取的TB-EPS中DNA含量達11.9 mg/g，占TB-EPS總量的35.1%.文獻[6， 9]研究表明，甲醛可與細胞膜上的蛋白質和核酸進行結合，起到固定細胞的作用，從而降低NaOH提取TB-EPS時對細胞的破壞作用.然而，本文的研究結果顯示，采用甲醛+NaOH法對生物膜TB-EPS及其組分含量的提取效果與空白對照并無顯著差異，但甲醛的使用對EPS的檢測分析影響較大[30]，因此不適合生物膜EPS的有效提取.

綜上所述，熱提法(60 ℃)對生物膜TB-EPS的提取效率最高，且TB-EPS中DNA含量最低，表明其對微生物細胞的破壞程度最小，可作為生物膜TB-EPS的提取方法.

2.3 UV-vis光譜分析

DNA是TB-EPS的組成部分之一[31]，若在TB-EPS 提取物中檢測出較高濃度的DNA，在某種程度上可作為細胞破裂程度的判別依據[4].由于DNA分子結構中含有共軛雙鍵，在波長260 nm處具有特征吸收峰[32].因此，本文為進一步驗證不同方法在生物膜TB-EPS提取過程中對細胞的破壞影響，采用UV-vis光譜對TB-EPS進行分析，結果如圖4所示.

圖4 不同提取方法所得生物膜TB-EPS紫外可見光光譜圖Fig.4 UV-vis spectra of biofilm TB-EPS extracted by different methods

由圖4可以看出，采用熱提法(60 ℃)所提取的EPS在波長260 nm的吸收峰強度明顯最弱，表明其在生物膜EPS提取過程中對細胞的破壞程度最低，這與上述EPS組分含量分析結果是一致的(圖3).此外，蛋白質作為EPS的主要組分之一，分子結構上存在肽鍵，因此，在UV-vis光譜掃描波長范圍內具有特征吸收峰.文獻[33-34]研究表明，稀蛋白質溶液(20～100 mg/L)通常在波長200～225 nm內具有較強的吸收峰.由圖4分析可知，除空白對照樣品外，其余TB-EPS樣品在波長220 nm處均出現吸收峰.通過對比分析發現，采用EDTA法、NaOH法、H2SO4法、熱堿法和甲醛+NaOH法所提取的TB-EPS中蛋白質含量化學分析結果與其UV-vis光譜吸收峰的強弱難以對應，這可能是因為EDTA、甲醛、NaOH和H2SO4等化學試劑殘留會對TB-EPS 光譜分析產生干擾[5， 25].

3 結 論

(1) 雖然采用緩沖溶液作為提取液時，EPS的提取效率最高(242.7 mg/g)，但EPS中DNA含量也最高，約占16.5%，表明緩沖溶液對細胞破壞程度最大；相比之下，采用去離子水作為提取液，雖然對EPS提取效率略低(208.3 mg/g)，但EPS中DNA含量最低，約為6.7%.因此，選擇去離子水作為生物膜EPS提取液.

(2) 通過對生物膜TB-EPS含量及組分分析可知，熱提法(60 ℃)提取效率最高(132.0 mg/g)，且TB-EPS中DNA含量最低，約占7.0%，表明熱提法的提取條件溫和，對細胞破壞程度最輕，是生物膜TB-EPS提取的有效方法.

(3) 盡管CER法、EDTA法和超聲法對生物膜TB-EPS提取效率較高，但TB-EPS中DNA含量同樣也較高，表明其對細胞的破壞程度較大；NaOH法、H2SO4法、熱堿法和甲醛+NaOH法對生物膜TB-EPS提取效率相對較低，且對細胞破壞程度大，化學提取劑殘留還會干擾TB-EPS組分的準確測定.通過UV-vis光譜分析進一步證實，采用熱提法(60 ℃)提取生物膜TB-EPS的過程對細胞破壞程度最輕.

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ComparativeStudyonExtracellularPolymericSubstanceExtractionMethodforBiofilmsinBiologicalAeratedFilters

GUChaochao1a，GUOYanhai1a，SUNXuchao1a，LIUZhenhong1a， 1b，XUEGang1a， 1b，JIAHanzhong2，GAOPin1a， 1b

(a. College of Environmental Science and Engineering； b. State Environmental Protection Engineering Center for Pollution Treatment and Control in Textile Industry，1. Donghua University， Shanghai 201620， China；2. Xinjiang Technical Institute of Physics and Chemistry， Chinese Academy of Sciences， Urumqi 830011， China)

Eight different methods were adopted to extract extracellular polymeric substance (EPS) from biofilms in biological aerated filters using deionized water as extracting solution， and the extraction efficiency and component content of EPS were investigated. UV-vis spectra were used to analyze the degree of cell lysis during EPS extraction. The results show that the highest extraction efficiency of tightly bound EPS (TB-EPS) from biofilms is obtained using heating extraction method at 60 ℃ and EPS production is as high as 132 mg/g. Also， the degree of cell lysis is the lowest as the DNA content accounts for 7.0% of the total TB-EPS， indicating that heating is an efficient method for EPS extraction from biofilms.

biological aerated filter； biofilm； extracellular polymeric substance； heating extraction method； UV-vis spectra

1671-0444(2017)05-0720-07

2016-07-01

國家自然科學基金資助項目(51208086)；東華大學“勵志計劃”資助項目

顧超超(1992—)，男，山東臨沂人，碩士研究生，研究方向為水污染控制及水質安全.E-mail：1508313161@qq.com

高 品(聯系人)，男，副教授，E-mail：pingao@dhu.edu.cn

X 703.1

A

(責任編輯：徐惠華)