一種超靈敏檢測17β- 雌二醇電化學核酸適配體傳感器構建方法

平 婧， NUANAPA Chaisuwan， 柳建設

(東華大學 a． 環境科學與工程學院；b． 國家環境保護紡織污染防治工程技術中心， 上海 201620)

一種超靈敏檢測17β- 雌二醇電化學核酸適配體傳感器構建方法

平 婧a， b， NUANAPA Chaisuwana， b， 柳建設a， b

(東華大學 a． 環境科學與工程學院；b． 國家環境保護紡織污染防治工程技術中心， 上海 201620)

采用石墨烯(GS)-Nafion- 納米金(AuNPs)復合膜修飾玻碳電極(GCE/GS-Nafion-AuNPs)，構建一種靈敏度高且穩定性好的電化學核酸適配體傳感器，應用于環境內分泌干擾物——17β- 雌二醇(E2)的快速檢測.運用透射掃描電子顯微鏡(TEM)、循環伏安(CV)法和差分脈沖伏安(DPV)法，對該傳感器的形貌和電化學性質進行表征.研究表明，在GS、 Nafion和AuNPs協同作用下，修飾電極的電化學性能明顯提高.在優化試驗條件下，傳感器的電流信號(Ip)與17β- 雌二醇(E2)的濃度(c)的對數在0．002 5～0．300 0 μmol/L范圍內呈現良好的線性關系，回歸方程為Ip=8．899 4+ 1．049 4 logc，相關系數為0．994 1， E2濃度檢出限為0．83 nmol/L.該傳感器制作簡單、靈敏度高、檢出限極低以及具有良好的重現性和穩定性，有望應用于環境樣品中E2的檢測.

核酸適配體； 石墨烯； 納米金； 17β- 雌二醇

近幾年，由于內分泌干擾物(endocrine disrupting chemicals， EDCs)會對生態環境和人類健康造成不良影響而備受關注.其中雌二醇(Estradiol)是這類物質中活性最高的天然雌激素[1]，并且極低濃度的雌二醇就可能造成生物體生殖系統異常[2].在實際研究中，考慮到17β- 雌二醇(E2)的活性比17α- 雌二醇強，一般采用17β- 雌二醇作為研究對象[3].常規E2的檢測方法主要有免疫分析方法[4]、氣相色譜-質譜聯用法(GC-MS)[5]、液相色譜法(LC)[6]等，由于這些方法一般需要較為復雜的前處理，等待時間長，分析成本高，且儀器一般體積較大不易移動，所以不能實現原位檢測，不適合方法的推廣和實際樣品的應用[7-10].因此，發展一種快速、簡便且高靈敏度的17β- 雌二醇(E2)分析檢測方法具有重要的現實意義.

核酸適配體(aptamer)是利用體外指數富集的配基系統進化技術(SELEX)獲得的單鏈脫氧核糖核酸(DNA)或者核糖核酸(RNA)序列[11-12]，與抗體相比，其具有易修飾，特異性強，易于保存運輸等特點[13-14]，有望取代抗體成為新一代的生物識別分子.利用核酸適配體構建生物傳感器，并結合電化學分析方法的成本低廉、操作簡便、響應速度快等特點，特別適合環境痕量污染物的分析檢測[15-16].

本文以17β- 雌二醇為研究對象，采用石墨烯(GS)-Nafion- 納米金(AuNPs)復合膜修飾電極，制備一種無標記的核酸適配體傳感器.利用成膜性好的Nafion來分散GS，隨后修飾AuNPs，在增強導電性的同時，結合適配體5’端修飾的巰基(—SH)鍵來增加適配體的固定量.優化試驗條件，依據結合傳感器界面電流變化與E2濃度的對數成正比來定量測定17β- 雌二醇.與其他方法相比，該傳感器具有制作過程簡單、檢出限低、穩定性好等優點，有望實現大面積的推廣與應用.

1 試驗部分

1．1 儀器試劑

儀器：電化學工作站，上海辰華儀器有限公司， chi 760D型；移液槍，上海禾汽玻璃儀器有限公司；pH測試儀，德國WTW公司， Multi340i型；功率可調式超聲波清洗器，上海科導， SK2200HP型；磁力攪拌器，上海梅穎浦儀器儀表制造有限公司， X85-2S型恒溫版；超純水，美國賽默飛公司， EASY pure Ⅱ RF/UV型.

試劑：17β-雌二醇適配體，生工生物工程(上海)股份有限公司，其堿基序列[18]如下：

5’-SH-GCT-TCC-AGC-TTA-TTG -AAT-TAC-ACG - CAG-AGG-GTA-GCG-GCT-CTG-CGC-ATT-CAA- TTG-CTG-CGC-GCT-GAA-GCG-CGG-AAG- C-3’.

17β-雌二醇(97%+，美國Sigma)、石墨烯(南京先鋒納米材料科技有限公司)、 HAuCl4·4H2O、 K3Fe(CN)6、 Nafion(5%，美國Sigma)、無水乙醇(97%，上海禾汽化工科技有限公司)、硝酸、檸檬酸三鈉、硫酸(98%)、氯化鉀(分析純，上海化學試劑有限公司)、6- 巰基己醇(美國Sigma)、 Tris-HCl緩沖溶液(pH=7．4， Tris/EDTA(10 mmol/L/1 mmol/L))、雙酚A(>99%，生工生物工程(上海)股份有限公司)、4- 壬基酚(97%+，阿法埃莎(中國)化學有限公司).

1．2 納米金制備方法

制備納米金的玻璃器皿首先在王水中浸泡24 h， 然后經多次沖洗干凈并干燥后使用.配置1%的氯金酸水溶液于50 mL超純水(電阻率>18．2 MΩ·cm) 中，得到0．01 g/mL 氯金酸溶液.取一個圓底燒杯(100 mL)， 加入50 mL超純水，用移液槍準確移取0．5 mL配置好的溶液注入其中，加入磁子，將此燒杯放入(92±4) ℃油浴鍋中，在磁子劇烈攪拌下恒溫加熱.溫度保持在92 ℃，并在持續攪拌過程中加入1．6 mL的檸檬酸三鈉[17].前1～3 min 沒有明顯變化，3～5 min之后溶液開始變藍，隨后轉為藍偏紫色，繼續恒溫攪拌，大約25～ 30 min 之后溶液變紅，隨即變為澄清透亮的橙紅色，若氯金酸溶液放置時間過長，制備的溶液偏紫色.注意制備過程中須迅速加入檸檬酸三鈉溶液，并保持溫度恒定，避免制備的納米金顆粒過小.

1．3 石墨烯-Nafion復合膜的制備

在室溫條件下，將體積分數為5%的Nafion溶液用無水乙醇稀釋至體積分數為0．5%.用移液槍移取5 μL體積分數為5%的Nafion溶液緩慢加入到995 μL的無水乙醇中，然后在此溶液中加入分析天平稱量好的1 mg石墨烯，放入超聲波儀器中，超聲分散2 h，得到分散均一的GS-Nafion復合膜待用.

1．4 修飾電極的制備

分別用粒徑為0．10和0．05 μm的氧化鋁粉末打磨拋光玻碳電極(GCE， 4 mm)至鏡面程度，超聲清洗10 min后晾干(室溫)，晾干過程中始終保持電極清潔．

準確移取10 μL的GS-Nafion混合溶液滴于電極表面，室溫下自然晾干.取10 μL已分散好的AuNPs溶液滴涂，孵化30 min后，移取10 mL E2適配體覆蓋電極表面，恒溫孵育4 h，最后將電極浸泡在6- 巰基己醇溶液(MCH)中50 min，以封閉剩余的活性位點.將得到的GS-Nafion-AuNPs修飾電極置于4 ℃冰箱中保存待用.

1．5 測試方法

1．5．1 修飾電極的表征方法

選擇3電極體系進行循環伏安法的測量來表征不同修飾過程中的電流電壓特征.玻碳電極為工作電極，鉑絲電極為對電極，氯化銀為參比電極，掃速為50 mV/s，從電位-0．2～0．6 V范圍內進行掃描，得到循環伏安曲線圖并進行下一步分析.

1．5．2 修飾電極對E2的響應檢測

在室溫下，修飾電極在不同濃度的E2標準溶液(0．300 0、 0．050 0、 0．025 0、 0．005 0、 0．002 5 μmol/L)中于37 ℃恒溫培養箱中孵育30 min，然后置于5 mmol/L K3Fe(CN)6(0．1 mol/L KCl， pH=7．0)的測試底液中，選擇差分脈沖伏安(DPV)法進行測量，間隔時間為50 ms，在電位-0．2～0．6 V范圍內循環掃描，以峰電流值Ip對應E2標準溶液濃度的對數繪制標準曲線.

2 結果與討論

2．1 電極修飾材料的形態表征

GS-Nafion和GS-Nafion-AuNPs復合膜的透射電鏡圖如圖1所示.由圖1(a)可知，GS和Nafion形成了均一的復合膜.由圖1(b)可知， AuNPs被成功地修飾在的GS-Nafion復合膜上，其粒徑為12 nm左右，顆粒呈球形，分散良好，大小均勻.

(a) GS-Nafion

(b) GS-Nafion-AuNPs圖1 GS-Nafion和GS-Nafion-AuNPs復合膜的透射電鏡圖Fig．1 TEM images of the GS-Nafion and GS-Nafion-AuNPs

2．2 傳感器的電化學表征

a—GCE； b—GCE/GS-Nafio； c—GCE/GS-Nafion-AuNPs； d—GCE/GS-Nafion-AuNPs-aptamer； e—GCE/GS-Nafion-AuNPs-aptamer-MCH圖2 不同傳感器的循環伏安圖Fig．2 Cyclic voltammograms of different sensors

GCE、 GCE/GS-Nafion、 GCE/GS-Nafion-AuNPs、 GCE/GS-Nafion-AuNPs aptamer和GCE/GS-Nafion-AuNPs-aptamer-MCH在5 mmol/L K3Fe(CN)6的測試底液中的循環伏安曲線如圖2所示,掃速為50 mV/s.由圖2可知， Fe3+/Fe2+的氧化還原峰分別出現在+0．26和+0．19 V，Fe3+/Fe2+電子對在電極上展現了最好的電流響應.根據Randles-Sevcik方程[18]，計算GCE、 GCE/GS-Nafion和GCE/GS-Nafion-AuNPs的電活性面積分別為0．076、 0．140和0．184 cm2. GS-Nafion修飾的GCE電極活性面積為未修飾的2倍， GS提高了修飾電極的比表面積和電化學性能； GS-Nafion-AuNPs修飾后的GCE電極活性面積為未修飾的3倍，證明AuNPs進一步提高了GCE電極的電化學性能，也提高了電化學檢測方法的靈敏性.修飾上適配體后，如圖2中曲線d所示，電極的氧化/還原峰電流有所下降.這可能由于適配體本身不導電，阻礙了電極表面的電子傳遞，因而導致電流下降，說明適配體已被成功修飾在電極上.由圖2中曲線e可知，峰電流繼續下降，證明非導電的MCH也已被成功修飾在電極表面.

2．3 掃速對傳感器的影響

GCE/GS-Nafion-AuNPs核酸適配體傳感器在相同測試底液中以不同掃速(50～300 mV/s)進行掃描得到的循環伏安圖如圖3所示.由圖3可知，隨著掃速增加，峰電流明顯增加，電流與掃速成良好的線性關系，回歸方程分別為Ipc=13．335 1v+1．738 7，R2=0．991 8和Ipa=-8．249 8v-1．802 54，R2=0．979 9，其中，v為掃速，Ipc為氧化電流，Ipa為還原電流. 該電極反應受吸附過程控制.

圖3 核酸適配體傳感器在不同掃速(a～i：50～300 mV)下的循環伏安圖；插圖顯示的是氧化還原峰電流與掃描速率的依賴關系Fig．3 Cyclic voltammograms of the aptasensor at different scan rates： 50～300 mV/s; the inset shows the dependence of redox peak currents of scan rate

2．4 優化試驗條件

2．4．1 pH值對傳感器的影響

采用差分脈沖伏安法測量溶液pH值對E2檢測的影響，結果如表1所示，其中，I0表示適配體修飾電極峰電流值，I表示適配體與E2標準溶液結合后的峰電流值， ΔI(ΔI=I0-I)表示扣除空白后傳感器對E2的電流響應.由表1可知，當pH=7．0時，ΔI最高，即傳感器電流響應最好，因此測試底液選擇pH=7．0.

表1 不同pH值對適配體傳感器的影響Table 1 Effects of pH on the aptasensor

2．4．2 孵化時間對傳感器的影響

為測試適配體與樣品孵育時間對反應的影響，將電化學核酸適配體傳感器放入質量濃度為40 ng/mL的E2溶液中，在37 ℃條件下分別反應5、 10、 15、 25、 35、 45、 55 min，用循環伏安方法測定相同條件下傳感器的電流變化，結果如圖4所示.由圖4可知，在孵育開始階段，適配體與待測物需要反應一定時間，峰電流的變化幅度隨著時間的推移而逐漸減小，在25 min后，整個曲線區域平緩，說明溶液中的反應已基本達到平衡.因此，選擇試驗的孵育時間為25 min.

圖4 孵化時間對核酸傳感器的影響Fig．4 Effects of incubation time on the aptasensor

2．5 傳感器的性能表征

將E2用Tris-HCl緩沖溶液(pH=7．4)配成不同濃度的標準溶液(0．002 5、 0．005 0、 0．025 0、 0．050 0、 0．300 0 μmol/L)，在5 mmol/L K3Fe(CN)6的測試底液中，在優化條件下(適配體質量濃度為1 mg/L， 溶液pH=7．0，孵育時間為25 min)，得到差分脈沖伏安圖如圖5所示，在0．002 5～0．300 0 μmol/L 范圍進行線性擬合得到線性回歸方程為Ip=8．899 4+1．049 4 logc，如圖6所示，其中c為E2濃度，相關系數為0．994 1，證明峰電流與E2濃度的對數之間有良好的線性關系.根據臨界檢測信號值要落在單鏈修飾電極信號的3σ偏差外的原理，計算出本文方法的E2濃度檢測限為0．83 nmol/L.

a～e代表E2濃度，分別為：0．300 0、 0．050 0、 0．025 0、 0．005 0、 0．002 5 μmol/L圖5 傳感器差分脈沖伏安曲線Fig．5 Differential pulse voltammetry of the aptasensor

圖6 擬合峰電流對E2濃度logc的線性關系圖Fig．6 Linear fitting curves of Ip and logarithm concentration of E2

2．6 傳感器的選擇性、穩定性和重現性

為了考察核酸適配體傳感器的選擇性，考慮到實際環境中典型的環境內分泌干擾物并非單獨存在[19-20]，特選取其中較為典型的并且與E2結構相似的4- 壬基酚和雙酚A作為干擾物進行檢測.在相同試驗條件下將傳感器分別放置在相同濃度的空白樣品、4- 壬基酚和雙酚A溶液中，測定其電化學阻抗響應值，結果如表2所示，其中，R1表示適配體與E2結合后的電極表面阻抗值，R0表示適配體修飾電極表面阻抗值， ΔR=R1-R0表示扣除空白后E2的電化學阻抗響應值.由表2可知， ΔR越大，說明適配體與E2的特異性結合更好， E2的阻抗響應值遠高于雙酚A和4- 壬基酚，傳感器具有良好的選擇性.

表2 核酸適配體傳感器特異性分析Table 2 Specificity of the aptasensor for different analytes Ω

為了考察核酸適配體傳感器的重現性和穩定性，測試不同批次制備的20支修飾電極在優化條件下(適配體質量濃度為1 mg/L，溶液pH=7．0，孵育時間為25 min)對濃度為0．5 μmol/L E2溶液的電流響應，ΔI的相對標準偏差為3．2%，顯示重現性較好.將電化學核酸適配體傳感器置于測試底液中，掃描20圈，循環伏安圖譜顯示峰電流有所偏離，其相對標準偏差小于3．8%.將制備好的電化學核酸適配體傳感器置于4 ℃條件下密閉保存，每隔3 d取出進行循環伏安掃描，測試兩周之后電流值為初始電流值的91．6%，室溫下放置的修飾電極的阻抗響應值只有最初的67%.這是由于電極經GS-Nafion-AuNPs修飾后，表面更加穩定，從而可以借由適配體一端修飾的Au—S鍵提高該傳感器的穩定性.但在室溫條件下，外界溫度變化較大，可能會引起電極表面復合膜的變化，導致穩定性下降.

3 結 語

本文以石墨烯(GS)-Nafion-納米金(AuNPs)復合膜修飾玻碳電極，制備了一種超靈敏的核酸適配體傳感器.該傳感器利用Nafion成膜性好的特點來分散GS，再利用AuNPs來修飾，在增強導電性的同時，利用Au—S鍵來增加適配體的固定量，而GS的特殊結構也提供了更多的電子轉移通道，這樣可以更好地增加傳感器的靈敏度.該傳感器具有極強的特異型，與其他方法相比，具有靈敏度高、成本低廉、前處理簡便快捷以及可以實現原位檢測等特點，具有很好的應用前景和實際價值，對其他環境痕量污染物的快速檢測具有借鑒意義.

[1] CASEY F X M， LARSEN G L， HAKK H， et al． Fate and transport of 17β-estradiol in soil-water systems[J]． Enviremnental Science and Technology，2003，37(11)： 2400-2409．

[2] JOHNSON A C， BELFROID A， CORCIA A D．Estimating steroid estrogen inputs into activated sludge treatment works and observations on their removal from the effluent[J]． Science of the Total Environment，2000，256： 163-175．

[3] KAVLOCK R J． Overview of endocrine disruptor research activity in the United States[J]． Chemosphere， 1999，39 (8)： 1227-1236．

[4] 張明輝，吳蔓莉，楊瑞，等．利用酶聯免疫測定水中雌二醇[J]．分析試驗室，2015，34(1)：27-30．

[5] 馬麗莎，戴曉欣，謝文平，等． QuEChERS/GC-MS法同時測定魚、蝦中的雌二醇與己烯雌酚殘留[J]．分析測試學報，2015，34(1)：62-66+72．

[6] 范志影，劉慶生，常碧影．液相色譜串聯質譜法測定牛奶中的內源性雌激素[J]．分析試驗室，2015，34(7)：751-755．

[7] 田家英，譚睿婕，柳玉英，等．基于現場檢測和批試驗條件下雙酚A和雌二醇在沉積物上的分配系數[J]．環境工程技術學報，2017，7(2)：140-145．

[8] 姜會聰，任舒悅，王瑜，等．上轉換發光免疫層析法快速檢測牛奶中雌二醇[J]．食品研究與開發，2017，38(3)：119-123．

[9] 王丹華，陳盼盼，王宏亮．水產品中15種避孕藥的HPLC方法測定[J]．食品工業，2017，38(1)：310-314．

[10] 周雪妍，陳仁國，魏群利，等．液相色譜串聯質譜法檢測人血清雌酮、雌二醇[J]．臨床檢驗雜志，2015，33(5)：328-332．

[11] ELLINGTON A D， SZOSTAK J W． In vitro selection of RNA molecules that bind specific ligands[J]． Nature， 1990，346：818-822．

[12] TUERK C， GOLD L． Systematic evolution of ligands by exponential RNA ligands to bacteriophage T4 DNA-polymerase[J]． Science， 1990，249：505-510．

[13] BRIDONNEAU P， CHANG Y F， BUVOLI A V， et al． Site-directed selection of oligonucleotide antagonists by competitive elution[J]． Antisense and Nucleic Acid Drug Development， 1999，9：1-11．

[14] JENISON R D， GILL S C， PARDI A， et al． High-resolution molecular discrimination by RNA[J]． Science， 1994，263：1425-1429．

[15] 周云，丁辛，胡吉永，等．化學聚合和電化學聚合對聚吡咯/棉導電織物電性能的影響[J]．東華大學學報(自然科學版)，2016，42(6)：822-826．

[16] 黃子龍，趙昕，李英芝，等． MnO2/碳布復合材料的制備及其電化學行為[J]．東華大學學報(自然科學版)，2016，42(2)：167-172．

[17] LIU J， LU Y． Preparation of aptamer-linked gold nanoparticle purple aggregates for colorimetric sensing of analytes[J]． Nature Protocols， 2006，1(1)：246-252．

[18] KIM Y S， JUNG H S， MATSUURA， T， et al． Electrochemical detection of 17β-estradiol using DNA aptamer immobilized gold electrode chip[J]． Biosensors and Bioelectronics， 2007，22(11)：2525-2531．

[19] 吳唯，史江紅，陳慶彩，等．沉積物中雌激素及壬基酚、辛基酚、雙酚A的測定[J]．環境科學，2013， 34(2)：724-731．

[20] 史江紅，吳唯，張暉，等．高基質干擾污水中雌激素、雙酚A和烷基酚的共檢測研究[J]．給水排水，2013，39(11)：124-127．

AMethodfortheUltra-sensitiveDetectionof17β-estradiolBasedonElectrochemicalAptasensor

PINGJinga， b，NUANAPAChaisuwana， b，LIUJianshea， b

(a． College of Environmental Science and Engineering；b． State Environmental Protection Engineering Center for Pollution Treatment and Control in Textile Industry， Donghua University， Shanghai 201620， China)

The graphene (GS) and nano-gold (AuNPs) were both introduced into the Nafion film to develop a new matrix as the aptasensor platform for ultrasensitive detection of typical endocrine pollutants-17β-estradiol (E2)． The morphology and electrochemical properties of the proposed sensors were characterized by transmission electron microscopy (TEM)， cyclic voltammetry (CV) and differential pulse voltammetry (DPV)． Due to the synergistic effect of GS, Nafion and AuNPs， biosensor modified by GS-Nafion-AuNPs composites exhibits excellent electrochemical performance． Under the optimized conditions， the current response of the proposed aptasensor have good linearity with the logarithm concentration of 17β-estradiol from 0．002 5 to 0．300 0 μmol/L， and the detection limit is 0．83 nmol/L． With the advantages of simple preparation， high sensitivity， low detection limit， excellent reproducibility and stability， the proposed method could be used in the determination of E2 in environmental sample．

aptamer; graphene; nano-gold; 17β-estradiol

1671-0444(2017)05-0668-06

2017-04-13

國家自然科學基金資助項目(21377033，51508083)；中央高校基本科研業務費專項資金資助項目(2232015D3-22)；上海市重點學科建設資助項目(B604)

平 婧(1988—)，女，山東濟南人，博士研究生，研究方向為水環境檢測及環境電化學生物傳感器． E-mail：pj-2011@163．com

柳建設(聯系人)，男，教授，E-mail：liujianshe@dhu．edu．cn

O 657．1

A

(責任編輯：徐惠華)