抗PUF60抗體在炎性肌病患者中的分布特點(diǎn)及臨床意義

張亞妹 ，彭清林 ，王國春 ?

（1.北京大學(xué)中日友好臨床醫(yī)學(xué)院，北京 100029；2.中日友好醫(yī)院 風(fēng)濕免疫科，北京 100029）

抗PUF60抗體在炎性肌病患者中的分布特點(diǎn)及臨床意義

張亞妹1，彭清林2，王國春1?

（1.北京大學(xué)中日友好臨床醫(yī)學(xué)院，北京 100029；2.中日友好醫(yī)院 風(fēng)濕免疫科，北京 100029）

目的：檢測抗PUF60抗體在中國特發(fā)性炎性肌病（IIM）患者中的陽性率，并分析其相關(guān)的臨床意義。方法本研究共納入388例IIM患者[275例皮肌炎（DM）、76例多發(fā)性肌炎（PM）及37例肌炎-重疊綜合征]和167例健康對照（HCs）。酶聯(lián)免疫吸附測定（ELISA）測定入組患者及健康對照的抗體滴度，并聯(lián)合免疫印跡實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證ELISA結(jié)果的可靠性。結(jié)果抗PUF60抗體可見于各IIM亞組，陽性率均高于健康對照組，包括11.3%（P＜0.01）的DM、7.9%（P＜0.05）的PM和21.6%（P＜0.01）的肌炎重疊綜合征患者。在經(jīng)典DM中，該抗體常見于肌炎抗體陰性的患者（P＜0.05），并與技工手發(fā)生相關(guān)；且該抗體在無肌病性皮肌炎中陽性率較高，與皮膚潰瘍的發(fā)生相關(guān)。結(jié)論抗PUF60抗體在中國肌炎患者中普遍存在，且不同亞型的臨床相關(guān)性各異，提示抗PUF60抗體或其靶抗原PUF60可能在不同亞型的肌炎中參與了不同的致病過程。

特發(fā)性炎性肌病；抗PUF60抗體；剪接體

特發(fā)性炎性肌病 （idiopathic inflammatory myopathies，IIM）是一組以骨骼肌炎性浸潤伴全身多臟器受累的難治性異質(zhì)性自身免疫病，多發(fā)性肌炎（polymyositis，PM）和皮肌炎（dermatomyositis，DM）是IIM常見的臨床亞型[1]。IIM的自身抗體包括肌炎特異性自身抗體 （myositis specific autoantibodies，MSAs）和肌炎相關(guān)性自身抗體（myositis associated autoantibodies，MAAs）， 見于70%～80%的成人IIM患者和60%幼年性皮肌炎（juvenile dermatomyositis，JDM） 患兒[2]。 PUF60（poly-U-binding factor 60 kDa）蛋白由559個(gè)氨基酸殘基組成，是剪接體中U2snRNP的剪接因子，可通過誘導(dǎo)自身抗原表位擴(kuò)展進(jìn)而激發(fā)免疫反應(yīng)[3]。Livia等人研究發(fā)現(xiàn)，在干燥綜合征及高加索DM患者中均可檢測到抗PUF60抗體，22例亞裔DM患者均抗PUF60抗體陰性[4]。為進(jìn)一步明確抗PUF60抗體是否在中國IIM患者中表達(dá)，本研究檢測了該抗體在我國IIM患者中的表達(dá)情況，并分析總結(jié)了其臨床相關(guān)性。

圖1A 肌炎患者中抗PUF60抗體的分布特點(diǎn)

圖1B 4例IIM患者及HC的免疫印跡結(jié)果

1 資料與方法

1.1 臨床資料

（1）肌炎組：選擇1989年～2016年于我院住院治療的IIM患者388例，包括DM 275例、PM 77例、肌炎重疊綜合征36例。PM/DM的診斷符合1975年的Bohan/Peter標(biāo)準(zhǔn)，肌炎重疊綜合征（myositis-overlap syndrome）的診斷則以“肌炎并發(fā)其他類型的結(jié)締組織病”為依據(jù)[5]。在275例DM中，有41例為臨床無肌病性皮肌炎（clinical amyopathicdermatomyositis，CADM）患者，其診斷依據(jù)：DM患者有特征性皮疹的臨床表現(xiàn)而無肌肉受累的臨床癥狀，血清肌酸激酶正常或輕度增高，肌電圖、肌活檢和影像學(xué)檢查無或有輕度肌肉受累的證據(jù)，病程＞6 個(gè)月[6]。（2）健康對照組：我院門診體檢的健康者167名；男58名，女109名；年齡 19～45 歲，平均（38±7）歲；除外 RA、SLE、SS 等自身免疫疾病。所有血清采集分離后凍存于-80℃直至檢測時(shí)使用。本研究通過我院倫理委員會批準(zhǔn)（批準(zhǔn)文號 2013-6）。

1.2 ELISA法檢測血清中抗PUF60抗體

（1）包被：將商品化的重組 PUF60蛋白（美國，Origene，TP323492） 用 0.05M pH9.6 的碳酸鹽包被緩沖液稀釋至0.5滋g/ml，在每個(gè)聚苯乙烯板的反應(yīng)孔中加 100滋l，4℃過夜 （18～24h）。 （2）封閉：次日，PBS洗板，每孔加入200滋l含2%牛血清白蛋白（BSA）的洗滌緩沖液，37℃封閉 2h。 （3）加樣：棄去孔內(nèi)溶液并洗板，加1：200稀釋的血清100滋l至上述已包被好的反應(yīng)孔內(nèi)，室溫孵育60min。 （4）加酶標(biāo)抗體：洗板，每孔加入 1：30000稀釋的辣根過氧化物酶標(biāo)記的羊抗人二抗（美國，Abcam 公司）100滋l， 室溫孵育 0.5 h。 （5） 顯色：PBST洗板，各孔加入四甲基聯(lián)苯胺底物反應(yīng)液（中國，索萊寶公司）100滋l，室溫孵育 5～10min 后加入 100滋l反應(yīng)終止液（1mmol/L硫酸，中國，索萊寶公司）終止反應(yīng)，在450nm處測吸光度A值。

1.3 免疫印跡法檢測血清中抗PUF60抗體

（1）制樣：用PBS將商品化PUF60蛋白5倍稀釋，加入蛋白上樣緩沖液后沸水浴5min。（2）制膠：配制10%分離膠及5%濃縮膠，依次注入玻璃板間隙，選合適孔梳，制備上樣孔。（3）上樣：將protein ladder（美國，Thermo公司）及處理過的蛋白上樣后開始電泳，平均每孔蛋白量為0.5滋g。（4）轉(zhuǎn)膜：采用半干轉(zhuǎn)轉(zhuǎn)膜儀，將目的蛋白轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜（NC膜）上。（5）封閉：將NC膜放入5%脫脂奶粉封閉液中，室溫封閉2h。（6）孵育一抗：用5%脫脂奶粉按1：50比例稀釋患者血清，4℃過夜。（7）孵育二抗：TBST洗膜，用5%脫脂奶粉按1：2500比例稀釋辣根過氧化物酶標(biāo)記的羊抗人二抗（美國，Abcam公司），室溫反應(yīng) 1h。（8）顯色：用1：1混合的ECL化學(xué)發(fā)光底物A液和B液（美國，Pierce公司）將NC膜浸潤，放入凝膠成像儀進(jìn)行顯色。

表1 抗PUF60抗體陽性的DM患者的臨床特點(diǎn)

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

應(yīng)用SPSS16.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理。非正態(tài)分布者用中位數(shù)及四分位數(shù)來描述。計(jì)量資料組間比較分別采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)、方差分析、非參數(shù)Mann-Whitney U檢驗(yàn)和Kruskal-Wallis檢驗(yàn)；計(jì)數(shù)資料比較采用χ2檢驗(yàn)或Fisher精確檢驗(yàn)。

2 結(jié)果

2.1 抗PUF60抗體在DM、PM及肌炎重疊綜合征患者中的陽性率

DM及肌炎重疊綜合征患者的血清抗PUF60抗體水平均較對照組顯著升高 （均P＜0.01）。以HCs的平均血清抗PUF60抗體水平加3倍標(biāo)準(zhǔn)差為陽性臨界值 （0.249），計(jì)算抗體陽性率。抗PUF60抗體可見于11.3%（31/275）的DM患者，7.9%（6/76）的 PM 患者，21.6%（8/37）的肌炎重疊綜合征患者，均顯著高于 HCs（P＜0.01，P＜0.05），見圖1A。有趣的是，DM組中CADM患者的抗PUF60抗體水平顯著高于經(jīng)典DM患者 （P＜0.01），其抗體陽性率（9/41，22%）也顯著高于經(jīng)典DM 患者（22/240，9.2%，P＜0.05）。 另外，我們對 4例DM患者血清中的抗PUF60抗體水平進(jìn)行了免疫印跡實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證（見圖1B），發(fā)現(xiàn)其與ELISA結(jié)果之間均具有較好的一致性。

2.2 抗PUF60抗體與DM的臨床相關(guān)性

表1示，經(jīng)典DM患者中抗PUF60抗體陽性與技工手、抗PL-7抗體陽性及CD5+CD19+B細(xì)胞百分比升高相關(guān)，且與肌炎抗體陰性相關(guān)。CADM患者中抗PUF60抗體陽性者與發(fā)病年齡大、皮膚潰瘍、心臟受累、血沉及Th/Ts水平升高相關(guān)。我們進(jìn)一步分析了經(jīng)典DM患者中肌炎抗體陰性組的臨床特點(diǎn)，其抗PUF60抗體可見于17.6%（9/51）的患者，與皮膚潰瘍及CD5+CD19+B細(xì)胞水平升高均相關(guān)（均P＜0.05）。

2.3 DM患者抗PUF60抗體水平與疾病活動度的相關(guān)性

由2位風(fēng)濕免疫科主治醫(yī)師對31例抗PUF60抗體陽性的DM患者進(jìn)行肌炎活動度視覺模擬評分 （myositis activity of visual analogue scale，MYOACT），未發(fā)現(xiàn)抗 PUF60抗體水平與CK水平及MYOACT評分存在相關(guān)性（P＞0.05）。

我們對12例DM患者（8例抗PUF60抗體陽性和4例陰性）隨訪12～27個(gè)月（中位時(shí)間12個(gè)月）。患者潑尼松用量為5mg/d～38mg/d。隨訪中10例 （83.3%）對激素和/或免疫抑制劑治療反應(yīng)良好，血清CK及LDH水平恢復(fù)正常，且MYOACT評分顯著改善，2例（16.7%）治療反應(yīng)性差（1例抗PUF60抗體陽性，1例陰性）。差值分析未發(fā)現(xiàn)8例抗體陽性的DM患者中抗PUF60抗體水平與CK及MYOACT評分存在相關(guān)性（P＞0.05）。

3 討論

本研究首次探討了我國IIM患者血清抗PUF60抗體的水平及臨床意義，發(fā)現(xiàn)抗PUF60抗體可見于我國DM、PM及肌炎重疊綜合征患者，且在CADM及肌炎重疊綜合征患者中的高陽性率提示了其與IIM特殊臨床亞型的相關(guān)性。抗PUF60抗體與經(jīng)典DM中技工手、抗PL-7抗體陽性及CD5+CD19+B細(xì)胞百分比升高相關(guān)；與CADM中發(fā)病年齡大、皮膚潰瘍、心臟受累、血沉升高和Th/Ts水平升高相關(guān)。以上研究結(jié)果證明，抗PUF60抗體在肌炎患者中普遍存在，且在不同肌炎亞型中的臨床相關(guān)性各異。

我們的初步研究結(jié)果與Livia等的研究并不完全一致。其研究發(fā)現(xiàn)，抗PUF60抗體見于30%（25/84）SS患者，與抗-Ro52抗體、類風(fēng)濕因子及高球蛋白血癥相關(guān)；還見于21%的高加索DM患者（48/213），與抗 TIFγ 抗體相關(guān)[4]。 我們研究發(fā)現(xiàn)，抗PUF60抗體不僅見于中國DM患者，也見于PM及肌炎重疊綜合征患者，此外，我們并未證實(shí)DM患者中抗PUF60抗體與抗TIFγ抗體的相關(guān)性。有趣的是，有研究發(fā)現(xiàn)抗FIR（PUF60的剪接變異體）抗體可見于早期結(jié)腸癌患者[7]，F(xiàn)IR在多種惡性腫瘤中也可見高表達(dá)[8]。還有研究證明PUF60能夠抑制轉(zhuǎn)錄因子FBP（FUSE結(jié)合蛋白）進(jìn)而抑制人腫瘤相關(guān)基因c-myc的表達(dá)[9]。因此，在DM合并腫瘤的特殊亞群中，應(yīng)當(dāng)進(jìn)一步開展有關(guān)PUF60及其剪接變異體（FIR）和針對該靶抗原的特異性抗體的研究，從而明確該特殊亞群中腫瘤發(fā)生的病理機(jī)制。

PUF60還能夠與YRNAs（小胞漿非編碼RNA）相互作用進(jìn)而參與自身免疫疾病的發(fā)生[10]。大部分YRNAs是Ro核糖體蛋白（RNPs）的重要組成部分[4]，而RNPs又與自身免疫疾病中免疫系統(tǒng)紊亂的發(fā)生密切相關(guān)[11]。自身抗原Ro/SSA和La/SSB同樣參與組成Ro RNPs[12]，在SS患者中還發(fā)現(xiàn)抗PUF60抗體與抗Ro-52抗體相關(guān)[4]。在中國SLE患者中同樣可檢測到抗PUF60抗體（陽性率 17.3%）， 且與抗 dsDNA、Sm、SSB抗體相關(guān)[13]。而抗PUF60抗體在肌炎重疊綜合征中的高陽性率不僅暗示其與混合結(jié)締組織病的相關(guān)性，也提示了PUF60蛋白在自身免疫中的重要作用。此外，我們發(fā)現(xiàn)經(jīng)典DM中抗PUF60抗體與抗PL-7抗體及技工手的發(fā)生相關(guān)，而后兩者均提示肌炎抗合成酶抗體綜合征的發(fā)生[14]。因此，為進(jìn)一步探索IIM中抗PUF60抗體與抗合成酶抗體的相關(guān)性，需要后續(xù)進(jìn)一步擴(kuò)大樣本細(xì)化研究。

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The prevalence and clinicalsignificance of anti-PUF60 antibody in patients with idiopathic inflammatory myopathy

ZHANG Ya-mei，PENG Qing-lin，WANG Guo-chun
Journal of China-Japan Friendship Hospital，2017 Oct，31（5）：274-278

Objective：To detect the existence and to analyze the clinical significance of anti-PUF60 antibody in Chinese patients with idiopathic inflammatory myopathy（IIM）.MethodsThis study involved 388 IIM patients[including 275 patients with dermatomyositis （DM），76 with polymyositis （PM）and 37 with myositis overlap syndrome]and 167 healthy controls（HCs）.An ELISA was developed to detect serum anti-PUF60 antibody and immunoblotting analyses were performed to validate the ELISA results.ResultsAnti-PUF60 antibody presented in 11.3%DM patients，7.9%PM patients and 21.6%patients with myositis overlap syndrome，and the antibody positive rates of them were significantly higher than HCs （P＜0.05，P＜0.01）.Classical DM patients with anti-PUF60 antibody had lower prevalence of currently known myositis antibodies（P＜0.05）and higher prevalence of mechanic’shands.Whiletheprevalenceofanti-PUF60 antibodywasparticularlyhigherin theCADM subgroup （29% ）and associated with the incidence of skin ulcer.ConclusionAnti-PUF60 antibody can be detected in Chinese patients with IIM，and it is associated with distinct clinical features in different rheumatic diseases.This finding indicates that anti-PUF60 antibody is associated with different pathogenesis processes in different IIM subgroups.

idiopathic inflammatory myopathies；anti-PUF60 autoantibody；splicesome

Author’s addressPeking University China-Japan Friendship School of Clinical Medicine，Beijing 100029，China

R593.26

A

1001-0025（2017）05-0274-05

10.3969/j.issn.1001-0025.2017.05.003

國家自然科學(xué)基金（91542121，81571603），首都衛(wèi)生發(fā)展科研專項(xiàng)項(xiàng)目（2016-2-4063）。

1* 本文通迅作者。

張亞妹（1992-），女，碩士研究生。

2017-05-20

2017-06-22