酶法提取葡萄酒渣多酚的含量與抗氧化性分析

李 浡，李雙石，岳明星，陳 思，李興娟

(北京電子科技職業學院，北京100176)

酶法提取葡萄酒渣多酚的含量與抗氧化性分析

李 浡，李雙石，岳明星，陳 思，李興娟

(北京電子科技職業學院，北京100176)

以釀酒葡萄皮渣為原料，研究提取物總酚含量及其體外抗氧化性。測定纖維素酶、β-葡聚糖酶、果膠酶、木瓜蛋白酶以及復合酶提取葡萄皮渣中的總酚含量，分析提取多酚的抗氧化性。結果表明，葡萄梗的總酚含量相對比葡萄皮、籽的要高，最高達6.794 g/100 g。復合酶提取多酚效果較好，果膠酶提取效果次之。葡萄梗總酚含量較高，葡萄籽的抗氧化性效果較好。本研究可為葡萄酒渣多酚物質的開發利用提供參考。

葡萄酒渣； 酶； 抗氧化性； 總酚含量

多酚物質是羥基直接連接在苯環上的酚類及聚合物的總稱。它們具有多種生理功能和藥理作用，如具有抗氧化性、能清除體內自由基、抗衰老、降血脂、降血壓、預防血管疾病、抗癌防癌、抑菌等作用[1]。葡萄多酚是一種植物多酚類活性物質，能溶于水，它廣泛存在于葡萄籽、葡萄皮與葡萄梗中。葡萄多酚具有較強的自由基清除能力[2]，葡萄中的多酚對炎癥、癌癥和心血管疾病等都具有很好的防治作用[3]。葡萄釀酒僅僅選取經壓榨的葡萄汁進行發酵，包含在葡萄梗、皮、籽中的很多有效成分并沒有被完全利用，大量酒渣被視為垃圾處置[4]，這些垃圾既污染環境又造成資源浪費。

多酚物質的提取方法很多，包括酶法、溶劑浸提法、微波提取法、超聲提取法等。考慮到超聲、微波的方法在擴大生產規模時的局限性，酶處理方法在使用上更加簡便，對設備和工藝的要求也相對較低[4]。酶反應條件溫和，選擇性強，近年來許多水解酶已被應用于葡萄酒渣中生物活性物質的提取研究中[5]。根據文獻報道[4，6-9]，多采用纖維素酶、果膠酶、鞣酸酶和復合酶等提取葡萄皮、籽和梗的多酚物質。

本實驗通過酶法提取釀酒葡萄皮、籽、梗的多酚物質，以DPPH自由基清除率以及FRAP法測定總抗氧化能力為指標考察釀酒葡萄皮、籽、梗的抗氧化活性，用不同酶解法的提取體系對其加以比較，并通過福林酚法（Folin-酚法）分別測定多酚物質的組成和含量，分析了抗氧化活性與多酚物質的組成和含量的關系，以評價葡萄酒渣的應用價值。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑及儀器

樣品處理：將赤霞珠葡萄皮、籽、梗60℃烘干后，研碎，過60目篩即得供試原材料葡萄酒渣樣品。

試劑及耗材：纖維素酶、β-葡聚糖酶、果膠酶、木瓜酶、復合酶（纖維素酶和果膠酶混合比例為1∶2）,天津利華酶制劑廠；DPPH、TPTZ,美國Sigma公司；三氯化鐵（FeCl3）、硫酸亞鐵（FeSO4）、無水醋酸鈉、沒食子酸（分析純），均為天津市華東試劑廠；無水乙醇、醋酸、鹽酸均為分析純，北京化工廠；水為超純水。

儀器設備：AR2140分析天平,梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司；TDZ5-WS多管架自動平衡離心機，北京醫用離心機廠；UV-5800紫外可見分光光度計，上海元析儀器有限公司；HHS11-Ni3B型電恒溫熱水浴鍋，北京長安永創科學儀器有限公司。

1.2 溶液的配制

1.2.1 DPPH儲備液

準確稱取DPPH 0.00975 g，用無水乙醇定容到250 mL容量瓶中，超聲后使其充分溶解得到濃度為100 μmol/L的DPPH儲備液，置于冰箱中冷藏備用。

1.2.2 TPTZ工作液

TPTZ(10 mmol/L)溶液：稱取312 mg的TPTZ溶于100 mL的40 mmol/L鹽酸溶液中。

20 mmol/L的三氯化鐵溶液：稱取六水合三氯化鐵0.54 g溶于100 mL水中。

pH3.6的醋酸緩沖液：稱取無水醋酸鈉10.2 g，加入40 mL醋酸，再用水定容到500 mL。

TPTZ工作液：將上述溶液按10∶1∶1比例配制即得到TPTZ工作液。

1.3 樣品的制備

分別取葡萄皮、籽、梗∶酶=1000∶1（W/W），在60℃下酶解90 min，并在30℃中恒溫水浴浸提0.5 h，5000 r/min離心10 min后收集上清液。

1.4 總酚含量的測定

葡萄皮、籽、梗樣品的總酚含量采用福林-肖卡法[10]測定，取50 μL的提取液，加入2.5 mL稀釋10倍的福林肖卡試劑和7.5 g/100 mL碳酸鈉溶液2 mL，混勻，45℃條件下避光反應15 min后于765 nm波長處測定吸光度，每個處理重復3次，結果以沒食子酸等價值表示(mg/100 g)。

1.5 抗氧化性測定

1.5.1 DPPH自由基消除能力測定

取0.5 mL按1.3方法制得的葡萄皮、籽、梗樣品，加入2.5 mL含100 μmol/L DPPH的乙醇溶液，混勻，室溫放置30 min后，5000 r/min離心5 min，在517 nm處測定吸光值（A樣），以5000 r/min離心5 min過后的上清液調儀器零點；同時檢測2.5 mL含100 μmol/L DPPH的乙醇溶液與0.5 mL蒸餾水的吸光值（A0）。對DPPH自由基的清除率（%）=[（A0-A樣）/A0]×100%。

1.5.2 FRAP法測定抗氧化能力

配制不同質量濃度的FeSO4溶液50 μL，各加入3.0 mL TPTZ工作液，37℃水浴30 min，測定595 nm處的吸光度。以蒸餾水為空白樣調零。以吸光度為縱坐標，FeSO4質量濃度為橫坐標繪制標準曲線。取1.0 mL按1.3方法制得的葡萄皮、籽、梗樣品，以蒸餾水定容到10 mL，準確吸取稀釋液50 μL，加入3.0 mL TPTZ工作液，37℃水浴30 min，測定595 nm處的吸光度。抗氧化能力用FeSO4標準溶液的濃度來表示。

2 結果與分析

2.1 標準曲線的繪制

以沒食子酸標準溶液繪制標準曲線，其標準溶液濃度分別為 0、120 mg/L、240 mg/L、360 mg/L、480 mg/L、600 mg/L、720 mg/L，測定吸光度值，繪制標準曲線。標準曲線的回歸方程為y=0.0012x+0.1016,R2=0.9910。

2.2 總酚含量的測定

根據步驟1.4中總酚含量的測定，分別對不同酶提取的葡萄皮、籽和梗中的總酚含量進行測定，結果見表1。

2.3 抗氧化性測定

2.3.1 DPPH自由基清除能力測定

按照1.5.1中的操作步驟，測定A0和A樣，測定不同酶提取的葡萄皮、籽、梗樣品的多酚對DPPH自由基的清除率，實驗結果為測定3次，取平均值，見表1。

2.3.2 FRAP法測抗氧化能力

按照1.5.2中的操作步驟，分別取1.0 mmol/L、2.0 mmol/L、4.0 mmol/L、6.0 mmol/L、8.0 mmol/L、10.0 mmol/L不同質量濃度的FeSO4溶液，繪制標準曲線，見圖1。標準曲線的回歸方程為y=0.0876x+0.012，R2=0.9988。

圖1 FeSO4溶液的標準曲線

測定不同酶提取的葡萄皮、籽、梗樣品多酚在595 nm處的抗氧化能力，實驗進行3次，取平均值，結果見表1。

由表1可以看出，總酚含量測定中，無論哪種酶提取的葡萄皮、籽和梗的多酚，葡萄梗的總酚含量相對比葡萄皮、籽的要高，最高達6.794 g/100 g。在幾種酶提取的皮、籽和梗的多酚總量測定中，復合酶提取的總量較高，果膠酶其次。果膠酶適合提取葡萄皮、籽、梗中的有效物質，原因可能是葡萄皮渣中有果膠，果膠酶能夠與其特殊部位進行特異性結合，比其他幾種酶的水解度要高。

表1 總酚含量和抗氧化能力的測定

在對自由基清除率考察中，幾種不同酶提取的葡萄皮、籽、梗樣品，復合酶和果膠酶提取的多酚對自由基清除率較高，分別為93.58%、95.78%、94.30%。從不同酶提取皮、籽、梗的多酚對DPPH自由基清除率來看，葡萄籽多酚的平均自由基清除率最高，達到92.25%，其次為葡萄梗多酚的清除率達到了89.70%，葡萄皮多酚的平均清除率為89.16%。

在葡萄皮、籽、梗中使用幾種不同的酶對其進行水解，結果表明，復合酶和β-葡聚糖酶提取多酚的抗氧化性相對較強。分別從不同酶提取皮、籽、梗的多酚抗氧化性來看，葡萄梗的抗氧化性最高，達到了5.411。

從以上結果得知，不同酶法提取的葡萄梗總酚含量較高，而抗氧化性也相應比較高。葡萄梗作為生產葡萄酒第一道工序中的廢棄物，由于大量被丟棄，對環境造成一定的污染。能夠開發和利用葡萄梗中的多酚物質，既能減少環境污染，又能充分利用資源[11]。葡萄皮、籽的總酚含量和抗氧化性并沒有對應性，總酚含量和抗氧化性的對應規律并不明顯，部分原因由于總酚中的一些酚類不具有抗氧化活性。

3 結論

本實驗測定了不同酶提取葡萄皮、籽、梗的總酚含量，果膠酶的提取效果相對較好。葡萄梗總酚含量較高，抗氧化性效果較好。為葡萄梗的開發和利用提供了參考依據。

[1]牛春艷,姜曉坤.葡萄皮渣中多酚物質提取工藝的研究[J].遼寧化工,2011,40(9)：917-919.

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[3]ENGELBRECHTA M,MATTHEYSE M,ELLIS B,et al.Proanthocyanidin from grape seeds inactivates the PI3-kinase/PKB pathway and induces apoptosis in a colon cancer cell line[J].Cancer letters,2007,258(1)：144-153.

[4]楊云裳,李帥斌,李春雷,等.酶法浸提釀酒葡萄果渣中多酚的最優工藝[J].蘭州理工大學學報,2013,39(3)：61-64.

[5]李雙石,李浡,馬越,等.葡萄梗(莖)中的生物活性物質研究現狀[J].食品工業科技,2014(7)：348-351.

[6]彭麗霞,黃彥芳,劉翠平,等.釀酒葡萄皮渣的綜合利用[J].釀酒科技,2010(10)：93-96.

[7]李婷,李勝,張青松,等.酶法提取葡萄皮渣中白藜蘆醇工藝研究[J].食品科學,2008,29(12)：194-197.

[8]錢時權,石亞中,伍亞華,等.纖維素酶對山葡萄渣中白藜蘆醇提取的影響[J].食品與發酵工業,2011,37(3)：207-209.

[9]張貴娟,楊濤,羅非君,等.白藜蘆醇的提取與檢測方法研究進展[J].食品與機械,2013,29(2)：234-237.

[10]JAVANMARDI J,STUSHNOFF C,LOCKE E J,et al.Antioxidant activity and total phenolic content of Iranian Ocimum accessions[J].Food chemistry,2003,83(4)：547-550.

[11]李浡,李雙石,蘭蓉,等.葡萄梗多酚物質的提取和成分分析[J].食品研究與開發,2015,36(4)：50-53.

Total Polyphenol Content and Antioxidant Activities of the Extract from Grape Skin Residues by Enzyme Method

LI Bo,LI Shuangshi,YUE Mingxing,CHEN Si and LI Xingjuan
(Beijing Polytechnic,Beijing 100176,China)

The total polyphenol content and the antioxidant activities of the extract from grape skin residues were investigated.The grape skin residues were extracted by cellulose,β-glucanase,pectinase,papain and compound enzyme respectively.The results suggested that,total polyphenol content of grape stems were about 6.794 g/100 g,higher than that of grape skin and grape seed.Compound enzyme had the best extraction effects,followed by pectinase.Besides,the antioxidant activities of grape seed were the best.This study provided useful reference for the utilization of polyphenols in grape skin residues.

grape skin residue;enzyme;antioxidant activity;total polyphenol content

TS262.6；TS261.4；TS261.9

A

1001-9286（2017）12-0037-04

10.13746/j.njkj.2017244

北京市屬高等學校人才強教計劃資助項目（PXM2016-014306-000005）；北京電子科技職業學院院內重點課題（2017Z005-005-KXB）。

2017-09-11

李浡（1973-），女，副教授，博士，研究方向為食品生物技術。

李雙石。

優先數字出版時間：2017-10-27；地址：http://kns.cnki.net/kcms/detail/52.1051.TS.20171027.1103.007.html。

“續寫傳奇·再出發”董酒六十周年慶典在遵義舉行

本刊訊：2017年11月18日上午，“續寫傳奇·再出發”董酒六十周年慶典活動在遵義市董公寺董酒廠隆重舉行。遵義市市政府有關部門領導、行業專家、學者、新聞媒體，以及董酒廠全體員工共計600余人參加了此次慶典活動。活動儀式由中國酒類流通協會秘書長秦書堯主持。

上午9:00時活動開始，董酒股份有限公司總裁劉智濤為60周年慶典致歡迎辭，并向與會來賓介紹了董酒廠的相關發展歷史。董酒股份有限公司董事長蔡友平在慶典上發表重要講話，并公布了董酒未來40年的長遠發展目標規劃。在蔡董事長發言中的目標規劃中，董酒將在2018年—2057年內按照3個階段逐步發展，從打造名優品牌、產業鏈整合優化、成立科技學院、資本化運作等方面助力董酒的發展。

遵義市委市政府相關領導在慶典上講話中指出，遵義市接下來將成立白酒產業基金支持董酒在內的遵義白酒企業發展，實現白酒集散遵義，流通世界的目標，通過抓龍頭，建集群、強配套、鑄鏈條等措施，形成真正的集研發、生產、營銷、集散貿易為一體的集團產業鏈，以應對白酒行業的發展周期。

慶典上，還舉行了由董酒廠代表向當地小學贈送5000冊圖書的捐贈儀式，在場領導及嘉賓一起啟動了“董酒續寫傳奇再出發”儀式，并舉行了封壇儀式。慶典活動還舉行了全體董酒員工集體宣誓儀式，作為董酒的員工，每一個董酒人都會恪守真誠，認真釀好每一杯酒，為每一個喝董酒、喜愛董酒的朋友提供最好的佳釀！慶典結束后，董酒公司董事長蔡友平陪同與會領導及嘉賓參觀了董酒廠廠區，深入車間了解董酒的發展歷史及生產工藝。

下午14:00時，董酒公司在遵義桂花山大酒店舉行了“中國傳統白酒文化價值論壇暨董酒60周年紀念酒首發儀式”，與會嘉賓各抒己見，對中國傳統白酒的歷史及文化進行了討論。

蔡董事長表示，藉此60周年慶典契機，董酒將進入一個全新的發展階段，將從設施、技術的升級，人才的培養、配套設置的建設、全國銷售布局等角度，科學規劃今后四十年的發展目標和實現路徑，實現跨越式的發展，未來將形成以白酒板塊和健康產業為主的兩大支柱產業，力爭實現兩大產業歷史突破。董酒將不斷強化品牌傳播和與消費者的互動，擴大消費群體對董酒的認可和青睞，通過不斷擴大基礎消費群體來帶動董酒規模的大幅度提升；將不斷強化與上下游伙伴的合作，通過優勢互補，共同發展，合作共贏的生態合作模式，與合作伙伴共同成長，分享紅利。（曉文、螢子、小雨）