高效液相色譜法測(cè)定白酒中紐甜含量的不確定度評(píng)定

孫 潔，孫立臻，秦鳳姣，汪靈巧，張 瑋，高 興

（山東景芝酒業(yè)股份有限公司，山東安丘262119）

高效液相色譜法測(cè)定白酒中紐甜含量的不確定度評(píng)定

孫 潔，孫立臻，秦鳳姣，汪靈巧，張 瑋，高 興

（山東景芝酒業(yè)股份有限公司，山東安丘262119）

采用高效液相色譜法測(cè)定白酒中紐甜含量，并對(duì)其測(cè)定結(jié)果進(jìn)行不確定度分析，建立了不確定度來源分析因果圖和數(shù)學(xué)模型，通過計(jì)算各不確定度分量，得出紐甜的擴(kuò)展不確定度，找出影響紐甜不確定度的主要因素并加以有效控制，該評(píng)定對(duì)提高白酒中紐甜檢測(cè)結(jié)果的準(zhǔn)確度具有重要意義。

高效液相色譜； 白酒； 紐甜； 不確定度

紐甜是功能性甜味劑，對(duì)白酒香氣、口感有特殊的協(xié)調(diào)平衡作用。近幾年來，有些酒類企業(yè)為了自身利益，用液態(tài)發(fā)酵酒加紐甜等甜味劑勾兌冒充純糧釀造酒，對(duì)市場(chǎng)帶來不正當(dāng)競(jìng)爭。為了保障我國傳統(tǒng)純糧釀造酒釀酒工藝得以延續(xù)，鼓勵(lì)白酒生產(chǎn)企業(yè)提高并穩(wěn)定產(chǎn)品質(zhì)量，《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)食品添加劑使用標(biāo)準(zhǔn)》GB 2760—2014規(guī)定白酒中不得添加甜味劑等任何非自身發(fā)酵物，即發(fā)酵酒中不得添加任何甜味劑，因此對(duì)白酒中紐甜含量的準(zhǔn)確測(cè)定，將為企業(yè)白酒質(zhì)量控制和相關(guān)監(jiān)管部門規(guī)范市場(chǎng)行為提供重要依據(jù)。

測(cè)量不確定度是評(píng)定測(cè)量結(jié)果質(zhì)量的一個(gè)重要指標(biāo)。在分析檢測(cè)工作中,由于種種原因,分析結(jié)果往往帶有誤差,而不能得到真值。為評(píng)價(jià)測(cè)定結(jié)果的質(zhì)量,需要進(jìn)行不確定度的評(píng)定。不確定度愈小,結(jié)果與真值愈近,數(shù)據(jù)愈準(zhǔn)確。ISO/IEC 17025《檢測(cè)和校準(zhǔn)實(shí)驗(yàn)室能力的通用要求》指出，當(dāng)檢測(cè)結(jié)果處于產(chǎn)品標(biāo)準(zhǔn)要求的臨界值，有可能判定產(chǎn)品不合格時(shí)，應(yīng)給出測(cè)量不確定度。

根據(jù)GB/T 5009.247—2016《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)食品中紐甜的測(cè)定》原理，用高效液相色譜法測(cè)定白酒中紐甜的含量。根據(jù)CNAS—GL06《化學(xué)分析中不確定度的評(píng)估指南》、JJF 1059.1—2012《測(cè)量不確定度評(píng)定與表示》規(guī)定的方法，建立了數(shù)學(xué)模型，對(duì)高效液相色譜法測(cè)定白酒中紐甜進(jìn)行不確定度分析，同時(shí)在不確定度評(píng)定過程中，找出主要影響因素并加以有效控制，對(duì)提高白酒中紐甜檢測(cè)結(jié)果的準(zhǔn)確度具有重要意義。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑與儀器

白酒樣品：加入紐甜的白酒樣品。

試劑：紐甜標(biāo)準(zhǔn)品(C20H30N2O5，純度≥99.8%)，上海安譜公司；甲醇(CH3OH，色譜純)，上海安譜公司；辛烷磺酸鈉(C8H17NaO3S，色譜純)，上海安譜公司；磷酸（H3PO4，優(yōu)級(jí)純），天津科密歐公司；甲酸（CH3COOH，色譜純）；三乙胺（C6H15N，色譜純），上海安譜公司。

儀器設(shè)備：高效液相色譜儀(1120 Compact LC)，美國安捷倫公司；電子分析天平(FA2004，感量0.0001 g)，上海上平儀器公司；超純水系統(tǒng)(M illi-Q)，美國密理博公司；0.22 μm濾膜，有機(jī)系。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 色譜條件

色譜柱：Aglient TC-C18(2)柱 ，5 μm，250 mm×4.6 mm；流動(dòng)相：甲醇+離子對(duì)試劑緩沖液(70+30)；檢測(cè)波長：218 nm；流速：0.8 mL/min；進(jìn)樣量：50 μL；柱溫：30 ℃。

1.2.2 試劑的配制

混合提取液：分別吸取0.8 mL甲酸和2.5 mL三乙胺，加水定容至1000 mL，pH4.5。

離子對(duì)試劑緩沖液：稱取2.00 g辛烷磺酸鈉，用500 mL水溶解，加入1.0 mL磷酸，加水定容至1000 mL。

1.2.3 標(biāo)準(zhǔn)溶液的制備

標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液：準(zhǔn)確稱取0.1 g紐甜標(biāo)準(zhǔn)品，加混合提取液溶解定容至100 mL。標(biāo)準(zhǔn)工作液：分別吸取適量標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液用混合提取液配制成濃度分別為0.2 mg/L、1.0 mg/L、2.0 mg/L、5.0 mg/L、10.0 mg/L的系列標(biāo)準(zhǔn)工作液。

1.2.4 實(shí)驗(yàn)操作

準(zhǔn)確稱取10 g白酒樣品(精確至0.0001 g)于25 mL離心管中，在40℃水浴中氮吹濃縮至微干，加2 mL混合提取液，振蕩搖勻，再經(jīng)0.22 μm微孔有機(jī)濾膜過濾待用，以外標(biāo)法定量。

2 數(shù)學(xué)模型的建立和不確定度來源分析

2.1 數(shù)學(xué)模型

根據(jù)GB/T 5009.247—2016中測(cè)量結(jié)果的計(jì)算公式建立評(píng)定紐甜含量測(cè)量不確定度的數(shù)學(xué)模型。測(cè)量結(jié)果計(jì)算公式如下：

式中：X——樣品中紐甜的含量，mg/kg；

C——樣品中紐甜峰面積對(duì)應(yīng)的濃度，mg/L；

V——樣品定容總體積，mL；

F——回收率校正系數(shù)；

m——樣品質(zhì)量，g。

根據(jù)《化學(xué)分析中不確定度的評(píng)估指南》白酒中紐甜含量測(cè)定的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度為：

2.2 確定和分析測(cè)量不確定度的主要來源

由上述公式可知，紐甜含量測(cè)定的不確定度主要來源可歸為以下幾個(gè)方面：標(biāo)準(zhǔn)品稱量、標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制、標(biāo)準(zhǔn)工作曲線的擬合；樣品的稱量、定容體積、回收率等幾個(gè)方面，見圖1。

圖1 紐甜測(cè)定主要不確定度來源因果圖

3 不確定度分量評(píng)定

3.1 A類不確定度分析

取一白酒（無紐甜）樣品，加入1.5 mg/L紐甜標(biāo)準(zhǔn)品，在同樣條件下重復(fù)測(cè)定10次，測(cè)定結(jié)果見表1。

表1 n=10次獨(dú)立重復(fù)測(cè)量的測(cè)量值

由貝塞爾公式得出10次測(cè)定的實(shí)驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)偏差的相對(duì)不確定度為：

3.2 B類不確定度分析評(píng)定

3.2.1 紐甜標(biāo)準(zhǔn)溶液配制引入的不確定度

標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)不確定度包含標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的純度、天平的稱量和標(biāo)準(zhǔn)溶液配制引入的不確定度。

3.2.1.1 標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)純度P引入的不確定度UP

紐甜標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的純度為99.8%，按矩形分布處理，則純度引起的不確定度為：

3.2.1.2 天平稱量引入的不確定度

根據(jù)電子天平檢定證書，最大允許誤差為±0.01 mg，m測(cè)量值落在該區(qū)間的概率分布為均勻分布，包含因子，其標(biāo)準(zhǔn)不確定度為：Um=

稱取標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)紐甜為0.0500 g，則相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度為：

則標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)合成相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度為：

3.2.1.3 標(biāo)準(zhǔn)工作液配制過程中引入的不確定度

3.2.1.3.1 配制系列標(biāo)準(zhǔn)液過程中玻璃量具引入的不確定度

配制系列標(biāo)準(zhǔn)液過程中使用了A級(jí)1 mL、2 mL、5 mL移液管和A級(jí)50 mL、10 mL容量瓶。按照J(rèn)JG 196—2006《常用玻璃器皿檢定規(guī)程》都有相應(yīng)的容量允差。歐洲分析化學(xué)中心（EURACHEM）認(rèn)定其服從三角形分布，包含因子，則計(jì)算的標(biāo)準(zhǔn)不確定度見表2。

由表2數(shù)據(jù)合成的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度：

3.2.1.3.2 配制系列標(biāo)準(zhǔn)溶液過程中溫度引入的不確定度

根據(jù)檢定規(guī)程JJG 196—2006規(guī)定，檢定是在室溫20℃環(huán)境條件下進(jìn)行的，實(shí)驗(yàn)室一般定容在20℃±5℃條件下進(jìn)行。因?yàn)橐后w的膨脹系數(shù)遠(yuǎn)大于玻璃，因此，只需考慮前者即可。水的膨脹系數(shù)為2.1×10-4/℃，按照矩形分布，則計(jì)算的不確定度見表3。

由表3數(shù)據(jù)合成的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度：

則標(biāo)準(zhǔn)溶液配制產(chǎn)生的不確定度：

表2 標(biāo)準(zhǔn)溶液配制中玻璃量具引起的不確定度

表3 標(biāo)準(zhǔn)溶液配制中溫度引起的不確定度

3.2.1.3.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線擬合引入的不確定度分量U擬合

標(biāo)準(zhǔn)曲線產(chǎn)生的不確定度來源于其殘差的標(biāo)準(zhǔn)差，殘差為測(cè)量值與標(biāo)準(zhǔn)曲線擬合之差的絕對(duì)值分別配制濃度為 0.2 μg/mL、1.0 μg/mL、2.0 μg/mL、5.0 μg/mL、10.0 μg/mL的標(biāo)準(zhǔn)工作液。進(jìn)行測(cè)量后建立的標(biāo)準(zhǔn)曲線的回歸方程及相關(guān)系數(shù)、紐甜的標(biāo)準(zhǔn)曲線測(cè)量值（x）、擬合值（）、擬合值（）以及所得殘差（x-），結(jié)果見表4。

表4 標(biāo)準(zhǔn)曲線的測(cè)量值(x)和擬合值()和殘差值(x-)以及回歸方程和相關(guān)系數(shù)(r2)

表4 標(biāo)準(zhǔn)曲線的測(cè)量值(x)和擬合值()和殘差值(x-)以及回歸方程和相關(guān)系數(shù)(r2)

注：y=4.34518e-007，x+0.0552854，r2=0.999979。

484576 6062404 12076081 23926892 48115144 0.272 2.72 5.24 10.48 20.96 498747 6132576 11932105 23991445 48110123 14171 70172 143976 64553 5021

標(biāo)準(zhǔn)曲線的殘差為：

由擬合引起的相對(duì)不確定度：

式中：b為斜率，N為測(cè)量標(biāo)準(zhǔn)溶液的總次數(shù)，P為測(cè)量樣品的總次數(shù)。帶入數(shù)據(jù)計(jì)算得到紐甜的擬和不確定度：

3.2.2 樣品稱量、定容的不確定度

3.2.2.1 樣品稱量的不確定度

被測(cè)樣品質(zhì)量的不確定度主要來源于天平的最大允許誤差，標(biāo)準(zhǔn)不確定度為0.00577，樣品稱量10 g，則相對(duì)不確定度為：

3.2.2.2 樣品定容的不確定度

樣品在40℃水浴中氮吹濃縮至微干，加2 mL混合提取液，由2 mL移液管引入的不確定度。主要是移液管的容量允差和溫度引起的不確定度，在表2和表3中已經(jīng)計(jì)算，分別為U校準(zhǔn)=0.002041；U溫度=0.00061。

則V定容引起的不確定度：

3.2.2.3 回收率引起的不確定度

樣品前處理不完全或造成紐甜的損失，通過對(duì)酒樣（無紐甜）分別加入紐甜0.50 mg/L、1.00 mg/L、2.00 mg/L，對(duì)各濃度重復(fù)測(cè)定3次，計(jì)算加標(biāo)回收率，見表5。

酒樣(無紐甜)加標(biāo)0.50mg/L、1.00mg/L、2.00mg/L，所得的回收率的標(biāo)準(zhǔn)相對(duì)偏差的平均值S=0.87%，則標(biāo)準(zhǔn)不確定度為相對(duì)不確定度為

3.3 相對(duì)不確定度各分量匯總

表5 酒樣（無紐甜）加標(biāo)，重復(fù)測(cè)定3次所得回收率

表6 相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度分量

由表6中各相對(duì)不確定度合成樣品中紐甜含量結(jié)果的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度為：

3.4 擴(kuò)展不確定度

取置信概率P=95%，則k=2，計(jì)算擴(kuò)展不確定度。

相對(duì)擴(kuò)展不確定度 U=k×U（x）=2×0.0605=0.121 mg/L，由實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)計(jì)算的平均值為1.5，擴(kuò)展不確定度U=0.121×1.5=0.182 mg/kg≈0.2 mg/kg，因此高效液相色譜法測(cè)定白酒中紐甜含量X=（1.5±0.2）mg/kg；k=2。

3 結(jié)論

通過對(duì)白酒中紐甜含量的不確定度各個(gè)分量的分析與評(píng)定，得出該檢測(cè)方法的擴(kuò)展不確定度為0.2 mg/kg。由表6可以看出，標(biāo)準(zhǔn)溶液配制過程產(chǎn)生的相對(duì)不確定度分量對(duì)整個(gè)實(shí)驗(yàn)的相對(duì)不確定度貢獻(xiàn)是最大的。因此，在實(shí)驗(yàn)中對(duì)該環(huán)節(jié)要格外關(guān)注，嚴(yán)格執(zhí)行國家食品安全標(biāo)準(zhǔn)，使用計(jì)量檢定合格的計(jì)量器具減少不確定度分量，對(duì)提高檢測(cè)結(jié)果的準(zhǔn)確性，規(guī)范食品添加劑在食品中的使用行為具有重要意義。

[1]楊君,王建華,劉靖靖,等.食品中甜味劑的檢測(cè)技術(shù)研究進(jìn)展[J].化學(xué)分析計(jì)量,2013,22(5)：100-103.

[2]中華人民共和國國家衛(wèi)生和計(jì)劃生育委員會(huì).食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)食品中紐甜的測(cè)定：GB 5009.247—2016[S].北京：中國標(biāo)準(zhǔn)出版社,2016.

[3]全國食品工業(yè)標(biāo)準(zhǔn)化技術(shù)委員會(huì)釀酒分技術(shù)委員會(huì).固液法白酒：GB/T 20822—2007[S].北京：中國標(biāo)準(zhǔn)出版社,2007.

[4]中國合格評(píng)定國家認(rèn)可委員會(huì).化學(xué)分析中不確定度的評(píng)估指南：CNAS—GL06：2006[S].2006.

[5]全國法制計(jì)量管理計(jì)量技術(shù)委員會(huì).測(cè)量不確定度評(píng)定與表示:JJF 1059.1—2012[S].北京：中國標(biāo)準(zhǔn)出版社,2013.

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Evaluation of the Uncertainties in the Determination of Neotame Content in Baijiu by HPLC

SUN Jie,SUN Lizhen,QIN Fengjiao,WANG Lingqiao,ZHANG Wei and GAO Xing
（Jingzhi Distillery Co.Ltd.,Anqiu,Shandong 262119,China）

The content of neotame in Baijiu was measured by HPLC,the uncertainty analysis of the measurement results was performed,and the cause-and-effect diagram and the mathematical model for analyzing the uncertainty source were set up.Each uncertainty component was calculated to obtain the expanding uncertainty,and the major factors influencing the uncertainties in the measurement were found out and they were effectively controlled.This evaluation had an important significance for improving the accuracy of measurement of neotame content in Baijiu.

HPLC;Baijiu;neotame;uncertainty

TS262.3；TS261.7；TS261.4

A

1001-9286（2017）12-0078-05

10.13746/j.njkj.2017285

2017-11-03

孫潔（1966-），女，高級(jí)工程師，從事白酒質(zhì)量分析工作20多年。

2017年1—10月中國白酒、啤酒產(chǎn)量

本刊訊：據(jù)《中國白酒網(wǎng)》和《中國國際啤酒網(wǎng)》報(bào)道，2017年10月，中國白酒行業(yè)產(chǎn)量118.7萬千升，同比增長8.2%。2017年1—10月，中國白酒行業(yè)累計(jì)產(chǎn)量1048.6萬千升，同比增長5.6%。2017年10月，中國啤酒行業(yè)產(chǎn)量292.5萬千升，同比下降1.9%。2017年1—10月，中國啤酒行業(yè)累計(jì)產(chǎn)量3988.1萬千升，同比增長0.2%。（江源薦，黃筱鸝編輯）

來源：中國白酒網(wǎng) 2017-11-16；中國國際啤酒網(wǎng) 2017-11-17