淺低溫對老年大鼠心肌缺血再灌注損傷的保護作用

池 豪 楊東偉 劉新葉

(鄭州大學附屬鄭州中心醫院心血管內科，河南 鄭州 450007)

淺低溫對老年大鼠心肌缺血再灌注損傷的保護作用

池 豪 楊東偉 劉新葉

(鄭州大學附屬鄭州中心醫院心血管內科，河南 鄭州 450007)

目的探討淺低溫對老年大鼠心肌缺血再灌注損傷的保護作用。方法將48只老年大鼠隨機分為淺低溫組和對照組，每組24只。對照組大鼠在37℃平衡灌流30 min，缺血30 min，再灌注120 min；淺低溫組大鼠在37℃平衡灌流30 min，缺血30 min，34℃淺低溫下再灌注120 min。檢測心室線粒體和胞質細胞色素C水平，心肌組織中丙二醛(MDA)、三磷酸腺苷(ATP)含量和超氧化物歧化酶(SOD)活力及心肌梗死范圍。結果淺低溫組線粒體細胞色素C水平高于對照組(P<0.05)，胞質細胞色素C低于對照組(P<0.05)。淺低溫組大鼠試驗后心肌梗死面積低于對照組(P<0.05)。淺低溫組大鼠心肌組織中MDA含量低于對照組(P<0.05)，ATP含量和SOD活力高于對照組(P<0.05)。結論淺低溫對老年大鼠心肌缺血再灌注損傷具有保護作用，其機制可能與淺低溫能夠減少心室線粒體中細胞色素C的擴散、降低心肌組織MDA含量、升高心肌組織中ATP含量和SOD活力有關。

淺低溫；心肌缺血再灌注損傷

缺血再灌注損傷是缺血性心臟病治療后常見的病理生理現象，急性心肌梗死后冠狀動脈旁路移植術、急性心肌梗死后溶栓術、體外循環條件下心內直視術等都經歷心肌缺血再灌注過程，導致心肌缺血再灌注損傷。因此，減輕和預防心肌缺血再灌注損傷具有重要意義〔1〕。淺低溫治療是指將中心溫度控制在合適范圍的一種干預方法，對于院外心臟驟停成年患者可以給予持續12～24 h、32℃～35℃的低溫治療，對缺血再灌注損傷有保護作用〔2〕。老年患者機體伴隨一系列的病理生理變化，如心血管功能減退、自由基生成增多、藥物代謝改變、冷熱敏感性增強、心肌收縮功能減弱、線粒體功能下降、細胞壞死和凋亡的敏感性增加等〔3〕。本文探討淺低溫對老年大鼠心肌缺血再灌注損傷的影響，分析其對缺血再灌注損傷的保護作用及可能機制。

1 材料與方法

1.1材料 實驗動物：清潔級、健康、雄性、22～24月齡、體重345～555 g、老年Wistar大鼠48只，購自北京生命科學研究所，許可證號：SYXK(京)2015-0002。主要試劑：2，3，5-氯化三苯基四氮唑、抗細胞色素C單克隆抗體、抗小鼠IgG抗體(美國Sigma公司)，丙二醛(MDA)檢測試劑盒、三磷酸腺苷(ATP)檢測試劑盒和超氧化物歧化酶(SOD)檢測試劑盒(南京建成技術有限公司)。

1.2方法

1.2.1大鼠分組及處理 將48只大鼠隨機分為淺低溫組和對照組，每組24只。對照組大鼠在37℃下平衡灌流30 min，缺血30 min，再灌注120 min；淺低溫組大鼠在37℃下平衡灌流30 min，缺血30 min，34℃淺低溫下再灌注120 min。

1.2.2制備離體心臟灌注模型 將大鼠麻醉成功后固定到大鼠手術臺上，開胸取出心臟，并立即放入4℃預冷的灌流液中冷卻使心臟停搏，然后擠出心臟瘀血，夾住主動脈斷端提起心臟進行主動脈插管，以灌注液進行恒流灌注。淺低溫組降溫方法：將恒溫循環水浴箱中加入冰塊使水溫降至34℃，然后保持恒溫循環水浴箱溫度恒定。

1.2.3細胞色素C水平測定 灌注結束時每組取8只大鼠分離心室，并分離心室部分的漿膜下線粒體和胞質，以抗細胞色素C單克隆抗體為一抗，堿性磷酸酶標記的抗小鼠IgG抗體作為二抗，采用Western印跡法測定細胞色素C水平，計算與對照組光密度值的比值作為細胞色素C水平。

1.2.4心肌組織中MDA、ATP含量和SOD活力測定 每組取8只大鼠心肌組織加入蒸餾水制備成10%勻漿液，3 500 r/min離心15 min取上清液，測定心肌組織中MDA、ATP含量和SOD活力。

1.2.5心肌梗死范圍測定 每組取8只大鼠，再灌注結束后取下心臟，生理鹽水沖洗干凈，抽取1 ml 2，3，5-氯化三苯基四氮唑磷酸緩沖液注入主動脈根部，在37℃恒溫箱中孵育40 min，然后冷凍固定25 min，將心臟切成1 mm厚的切片，多聚甲醛固定，測定梗死區范圍，采用Image-ProPlus圖像處理軟件計算各組大鼠心肌梗死范圍。

1.3統計學方法 采用SPSS20.0軟件行t檢驗。

2 結 果

2.1兩組細胞色素C水平比較 淺低溫組線粒體細胞色素C水平(2.12±0.35)顯著高于對照組(1.00±0.02)(P<0.05)，胞質細胞色素C(0.42±0.13)顯著低于對照組(P<0.05)。

2.2兩組大鼠試驗后心肌梗死面積比較 淺低溫組試驗后心肌梗死面積〔(34.26±2.97)%〕顯著低于對照組〔(59.37±5.42)%，P<0.05〕。

2.3兩組心肌組織中MDA、ATP含量和SOD活力比較 淺低溫組心肌組織中MDA含量顯著低于對照組(P<0.05)，淺低溫組心肌組織中ATP含量和SOD活力顯著高于對照組(P<0.05)。見表1。

表1 兩組大鼠心肌組織中MDA、ATP含量和SOD活力比較

3 討 論

線粒體是對損傷比較敏感的細胞器，是細胞內合成ATP的主要場所，缺氧可以引起線粒體腫脹、自溶和崩解，可增加線粒體外膜的通透性，引起小分子物質擴散到胞質中，且線粒體形態的改變可引起線粒體功能障礙〔4，5〕。細胞色素C是一種水溶性小分子蛋白，位于線粒體內膜上，在線粒體膜的通透性增加時，細胞色素C容易從線粒體中擴散到細胞質中，細胞質中的細胞色素C可導致caspase蛋白活化，引起細胞凋亡；線粒體中細胞色素C減少時對呼吸鏈電子的傳遞有抑制作用，氧化磷酸化受到抑制使線粒體ATP生成障礙，從而導致細胞壞死〔6，7〕。本文發現淺低溫可減少缺血再灌注損傷后心肌梗死面積，對心肌具有保護作用；缺血再灌注損傷可引起線粒體中細胞色素C水平降低，胞質中細胞色素C升高，考慮缺血再灌注損傷大鼠心肌細胞線粒體中細胞色素C擴散到胞質中，從而引起線粒體功能障礙和形態變化，導致心肌損傷；而淺低溫有減輕線粒體損傷的作用，從而對心肌具有保護作用。

心臟需要足夠的能量維持正常的生理功能，是一個高耗能器官，缺血再灌注損傷的始動環節為心肌能量代謝障礙，心肌做功所需的主要能量來源為ATP，ATP的生成、利用在心肌功能中發揮重要作用〔8～10〕。氧自由基介導的脂質過氧化反應是缺血再灌注損傷的重要環節，在生理狀態下產生適量的氧自由基可以維持正常的代謝過程，當組織出現缺血或者缺氧時，機體抗氧化功能喪失或降低，產生大量的氧自由基，出現脂質過氧化作用，從而引起細胞功能結構發生變化，引起心肌損傷〔11，12〕。MDA可以反映心肌細胞中脂質過氧化程度，可以根據MDA水平了解缺血再灌注損傷過程中的心肌細胞氧化損傷程度〔13〕。SOD是重要的抗氧化酶之一，是心肌組織中氧自由基的天然清除劑，SOD活性可以反映機體對氧自由基的清除能力〔14，15〕。本文中淺低溫可以減少心肌細胞能量消耗，增加心肌細胞中ATP儲備，從而提高缺血再灌注損傷大鼠心肌組織中ATP含量，對缺血再灌注損傷發揮保護作用；淺低溫可以有效提高缺血再灌注損傷大鼠心肌組織中SOD活力，降低心肌組織中MDA含量，從而對缺血再灌注損傷發揮保護作用。

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A

1005-9202(2017)23-5747-03；

10.3969/j.issn.1005-9202.2017.23.002

河南省科技廳重點攻關項目(142102310460)

池 豪(1983-)，男，碩士，主治醫師，主要從事冠心病的臨床與介入診療研究。

〔2017-01-15修回〕

(編輯 徐 杰)