遲發型腦血管痙攣致腦缺血后神經元自噬

王子珍 楊 堃 鄭穿宜

(海南醫學院附屬醫院神經外科，海南 海口 570100)

遲發型腦血管痙攣致腦缺血后神經元自噬

王子珍 楊 堃 鄭穿宜

(海南醫學院附屬醫院神經外科，海南 海口 570100)

目的探討遲發型腦血管痙攣(DCVS)致腦缺血后神經元自噬的現象。方法建立自發性蛛網膜下腔出血(SAH)后DCVS兔模型，檢測腦組織含水量以確定模型成功程度。在二次注血后的不同時間處死兔，取痙攣血管供血區域腦組織進行Western印跡、免疫組織化學等檢測腦組織中神經元細胞壞死、凋亡和自噬現象。結果SAH兔模型腦組織中存在神經元細胞壞死、凋亡和自噬現象。梗死后24 h腦組織含水量相比梗死前增多(P<0.05)。Western印跡及免疫組化證實DCVS和神經元細胞自噬存在關聯。結論DCVS致腦缺血組織中存在神經元自噬現象，腦血管痙攣的程度與神經元自噬存在一定的關聯性。

遲發型腦血管痙攣(DCVS)；自發性蛛網膜下腔水血(SAH)；自噬現象

自發性蛛網膜下腔出血(SAH)是發病率最高的腦血管意外之一，顱內動脈瘤破裂出血是最常見的致病原因，遲發型腦血管痙攣(DCVS)是其最嚴重且常見的并發癥之一〔1〕。DCVS與很多因素有關，如一氧化氮(NO)、炎癥因子等，但機制尚未完全闡明。細胞自噬普遍存在于真核細胞中，是一種高度保守的細胞自我防御機制，是細胞在營養不足時誘發的適應性反應，可為各種生物學行為提供能量原料〔2，3〕。DCVS 后相應的供血區腦組織也處于供血不足狀態，可能為類似于缺血半暗帶的低灌注區或者大腦中動脈閉塞(MCAO)后的腦梗死〔4〕。因此設想，DCVS 后腦缺血組織中神經元自噬機制也可能被激活，并且與腦血管痙攣的程度可能存在一定的關聯性。

1 材料和方法

1.1SAH動物模型的建立 參照Bederson等〔5〕的報道采用頸內動脈穿刺法建立兔模型。取正常體健兔，腹腔麻醉后固定在硬板上，股動脈插管監測兔血壓，手術前及蛛網膜下腔出血后各測一次動脈血行血氣分析。分離固定右側頸總動脈(CCA)、頸外動脈(ECA)和頸內動脈(ICA)，吻合支對應結扎，將尼龍線從頸外動脈穿入頸內動脈部分，有阻力出現時進一步刺破血管，制作蛛網膜下腔出血模型，持續20 s將尼龍線取出，逐步結扎頸外動脈端，逐步恢復血流情況，縫合頸部切口。術中維持兔的正常生命狀態。假手術(sham)組除了不刺破血管壁外，其余操作均與實驗組一致。術后兔單籠飼養，注意保暖。

1.2腦水含量測定 麻醉藥深度麻醉大鼠(每組5只)后迅速處死取出腦組織，放在冰上，去除腦皮質表面的腦膜和血凝塊，作冠狀位切片。所有組織用電子天平稱量腦組織濕重，放入恒溫烤箱烘烤2 h至恒重，置于干燥缸冷卻后取出，測干重。腦組織含水量=(濕重-干重)。

1.3Western印跡蛋白免疫印跡 配制10%SDS-PAGE，每孔加入30 μg蛋白樣品。使用濕轉法電轉至PVDF膜，5%脫脂奶粉封閉2 h，1∶1 000 TBST稀釋一抗，4℃過夜；加入辣根過氧化物酶標記羊抗兔IgG(1∶5 000)稀釋，室溫孵育2 h；電化學發光法(ECL)檢測。實驗重復3次。采用的抗體：抗-LC3(LC3-Ⅰ和LC3-Ⅱ),抗-酶切Caspase-3,抗-Fodrin，抗-LAMP1，抗-tubulin。

1.4免疫組織化學 取與痙攣血管相應的供血區兔腦組織，采用 ABC 法進行免疫組化染色，然后在共聚焦顯微鏡下觀察。選用的抗體包括抗-LC3(LC3-Ⅰ和 LC3-Ⅱ)、抗-酶切Caspase-3、抗-Fodrin、抗-LAMP1及抗-tubulin。

1.5統計與分析 采用SPSS20.0軟件行t檢驗。

2 結 果

2.1一般生理情況 在整個實驗過程中，時刻監測兔的動脈壓、血壓和心率，建模前和蛛網膜下腔出血后分別測定血pH值、PO2、PCO2和血糖水平，見表1。sham組兔術后無動物死亡，死亡率為0%；SAH組兔死亡率為41.1%(37/90)。

表1 各組動物一般生理狀況比較

2.2腦組織含水量測定 大鼠蛛網膜下腔出血后腦組織含水量較sham組(0.60±0.09)相比均明顯升高，其中24 h后腦水腫達到高峰(0.85±0.13)，72 h后腦水腫有所下降(0.72±0.08)，但仍高于sham組(P<0.05)，6 h腦組織含水量為0.76±0.11。

2.3Western印跡分析自噬相關蛋白的表達變化 自噬相關蛋白在sham組呈現低表達，大鼠蛛網膜下腔出血后LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ較sham組明顯升高。與LC3-Ⅰ的變化大致相仿，Beclin1和Atg5的表達在出血24 h后達到最高，與sham組相比有統計學差異(P<0.05)。見圖1，表2。

2.4免疫組織化學檢測自噬相關蛋白的表達 免疫組化結果見圖2，自噬相關蛋白在sham組的腦組織中呈低表達，在蛛網膜下腔出血24 h后Atg5、Beclin1和LC3-Ⅰ的表達增高。表明蛛網膜下腔出血24 h后自噬蛋白在腦組織中表達明顯升高。

圖1 Western印跡分析蛛網膜下腔出血后Atg5、Beclin1和LC3-I蛋白表達的變化

表2 Western印跡分析自噬相關蛋白的表達變化

與sham組比較：1)P<0.05

圖2 免疫組織化學檢測蛛網膜下腔出血后Atg5、Beclin1和LC3-I在腦組織的表達變化(×40)

3 討 論

目前研究發現，腦梗死腦組織中存在神經元自噬現象，具有神經保護作用。體外和體內腦缺血實驗模型中，無氧狀態下神經元在幾分鐘內就會死亡，中風后幾分鐘內無血區就發生神經元壞死。

在缺血壞死區的周圍，神經元不能得到足夠的血供的低灌注區被命名為“缺血半暗帶”，而缺血半暗帶被認為與延遲性神經元死亡有關〔5〕。在缺血半暗帶中caspase-3 激活也有Beclin 1、LC3、BNIP3等自噬相關基因的激活，表明其中可能同時存在凋亡和自噬〔6,7〕。Xue 等〔8〕發現，細胞凋亡的半胱氨酸蛋白酶被阻抑后，細胞內的線粒體被選擇性清除，從而缺血后自噬機制被激活，受損的線粒體被清除、凋亡終止，但線粒體的清除能夠被 bafilomycin A1(BFA，一種自噬體和溶酶體融合的阻滯劑)阻斷。目前被較多研究者接受的一個觀點是，腦缺血首先啟動凋亡路徑，缺氧和內質網應激觸發自噬體形成并清除受損的線粒體，阻斷凋亡，通過異化能量生成保持細胞穩態，避免細胞壞死。然而如果腦灌注不足長時間得不到糾正，高度的“自噬應激”可導致大量溶酶體激活，最后細胞死亡〔9〕。而自噬可以有效地清除受損的細胞器和大分子，將大分子物質再循環以提供 ATP和合成新的大分子，保持細胞內的穩態和利于細胞生存。過度的自噬激活就會導致自噬性細胞死亡〔10〕。

Wen等〔11〕用MCAO模型研究局灶性缺血，發現缺血腦組織存在自噬體和自噬溶酶體，自噬抑制劑3-MA、BFA 和組織蛋白酶抑制劑預先在腦室內應用可以顯著減少梗死體積、腦水腫及運動障礙。而且有研究顯示蛛網膜下腔出血后存在自噬現象〔12〕。所以我們可以推測DCVS后可能會出現自噬現象。

目前關于細胞死亡的討論有很多，最常見也被公認的有細胞壞死、細胞程序性死亡(細胞凋亡)、細胞自噬型死亡。自噬與凋亡不完全相同，他們兩者之間的關系相對復雜，功能情況互相調控，在特定環境下，如體外應激，細胞自噬可以一定程度適應應激條件，抑制部分細胞凋亡，在其他細胞內的背景下，自噬性細胞死亡可以誘導非正常細胞的損傷〔13,14〕。在一般正常條件下，同樣的應激條件對細胞凋亡和細胞自噬的誘導是無差別的，但是因為二者敏感閾值不同而導致其性質不同，二者的性質受胞內物質分解代謝水平的調節，在細胞內可同時存在自噬和凋亡，盡管多數情況下細胞通過適應應激，但是如果自噬嚴重，能夠完全導致細胞死亡〔15〕。已有學者證明自噬可以被凋亡信號誘發，而且可以在凋亡過程中持續存在自噬現象，但是自噬能否完全獨立地誘導細胞死亡還需要進一步探討。在果蠅唾液腺中激活類固醇能誘導自噬小體〔16〕，水解caspase降低其活性可以抑制自噬的出現〔17〕，同時Beclin1上調可以提高caspase活性，進而誘導細胞凋亡〔18〕，這些都證明了自噬與凋亡在細胞死亡程序中扮演相似的重要功能。

細胞死亡是錯綜復雜的機制作用，本實驗證實SAH后自噬激活存在于DCVS后的腦缺血中，而自噬在SAH發生過程中的具體機制尚需進一步探討。

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Delayedvasospasminducedneuronalautophagythroughcerebralischemia

WANGZi-Zhen,YANGKun,ZHENGChuan-Yi.

DepartmentofNeurosurgery,theAffiliatedHospitalofHainanMedicalCollege,Haikou570100,Hainan,China

ObjectiveTo investigate the delayed vasospasm after cerebral ischemia-induced neuronal autophagy phenomenon.MethodsDelayed vasospasm after subarachnoid hemorrhage model rabbit brain was made, brain water content was detected to determine the extent of the success of the model. Neuronal cells in brain tissue necrosis, apoptosis and autophagy were detected by Western blot and immunohistochemistry. The expression of autophagy antibodies in rabbit brain model was detected by Western blot. The expression of autophagy protein in detection of vascular spasm region was detected by immunohistochemistry.ResultsThe model of rabbit was successful. Rabbit brain tissue showed neuronal necrosis, apoptosis and autophagy. Compared with before infarction, A the brain water content was increased fter infarction 24 h. Western blot immunohistochemistry confirmed vasospasm and delayed neuronal cells from an association between macrophages.ConclusionsThe presence of cerebral ischemia and neuron autophagy exist in the DCVS model, the degree of cerebral vasospasm is partly related to neurons autophagy.

DCVS; SAH; Autophagy

國家自然科學基金項目(No.81260371)；海南省自然科學基金項目(No.20158300)

楊 堃(1965-)，男，主任醫師，博士，碩士生導師，主要從事腦膠質瘤的基礎與臨床研究。

王子珍(1966-)，男，副主任醫師，主要從事神經外科疾病診治研究。

R734.9

A

1005-9202(2017)23-5749-03；

10.3969/j.issn.1005-9202.2017.23.003

〔2017-01-15修回〕

(編輯 李相軍/徐 杰)