N-甲基-D-天冬氨酸受體阻斷對大鼠海馬神經元癲癇樣放電模型泛連接蛋白-1表達的影響

羅海龍 賈 茜 姜愛英 郭艷芹 董 妍 畢鵬翔

(牡丹江醫學院附屬紅旗醫院神經內科，黑龍江 牡丹江 157000)

N-甲基-D-天冬氨酸受體阻斷對大鼠海馬神經元癲癇樣放電模型泛連接蛋白-1表達的影響

羅海龍 賈 茜 姜愛英 郭艷芹 董 妍 畢鵬翔

(牡丹江醫學院附屬紅旗醫院神經內科，黑龍江 牡丹江 157000)

目的觀察N-甲基-D-天冬氨酸(NMDA)受體阻斷對大鼠海馬神經元癲癇樣放電模型神經元細胞活力，凋亡及泛連接蛋白(Panx)-1表達的影響。方法取SD新生乳鼠雙側海馬，體外培養海馬神經元至第9天，經鑒定的海馬神經元隨機分為正常對照組、模型組和MK-801(地卓西平，NMDA受體拮抗劑)組。正常對照組為正常細胞的細胞培養液培養3 h后恢復維持培養液；模型組為無鎂細胞外液培養3 h后恢復維持培養液；MK-801組加入含10 μmol/L MK-801維持培養液預保護30 min，更換為無鎂細胞培養液培養3 h 后恢復維持培養液。模型建立24 h后，采用細胞計數試劑盒(CCK-8)檢測神經元細胞活力，分別采用末端脫氧核苷酸轉移酶介導的dUTP缺口末端標記測定法(TUNEL)法和流式細胞儀膜聯蛋白V-異硫氰酸熒光素/碘化丙啶(Annexin V-FITC/PI)雙染法檢測神經元凋亡，采用蛋白質印跡法(Western印跡)檢測神經元Panx-1表達，采用實時熒光定量PCR(Real Time-PCR)檢測神經元Panx-1 mRNA表達。結果與模型組比較，MK-801組神經元細胞活力顯著升高(P<0.05)，神經元凋亡指數和凋亡率、Panx-1表達、Panx-1 mRNA表達顯著降低(P<0.05)。結論NMDA受體阻斷可抑制大鼠海馬神經元癲癇樣放電模型神經元損傷，發揮神經元保護作用，并抑制神經元Panx-1表達。

癲癇；N-甲基-D-天冬氨酸(NMDA)受體；泛連接蛋白(Panx)-1

癲癇(Epilepsy)是常見的神經系統疾病，發病率較腦血管疾病略低，主要表現為腦細胞突然異常的過度放電，導致腦功能失調〔1，2〕。流行病學資料顯示，老年人癲癇的發病率較高，究其病因具有復雜性和多樣性特點〔3〕。目前并沒有徹底研究清楚癲癇的發病機制，治療方法主要以對癥治療為主，故治療效果往往欠佳〔4，5〕。研究發現，N-甲基-D-天冬氨酸(NMDA)受體過度激活是一個重要的導致癲癇的原因〔6，7〕。關于NMDA受體阻斷對癲癇神經元的影響鮮見報道。本研究擬采用體外建立大鼠海馬神經元癲癇樣放電模型，觀察阻斷NMDA受體對模型神經元損傷的作用及對泛連接蛋白(Panx)-1的影響。

1 材料與方法

1.1實驗動物 12只SPF級新生24 h內SD大鼠乳鼠，雌雄不限，體重5～12 g，由哈爾濱醫科大學動物實驗中心提供，實驗動物使用許可證號：SYXK(黑)2015-007，實驗動物合格證號：SCXK(黑)2015-001。

1.2實驗藥物及主要試劑 NMDA受體拮抗劑MK-801(地卓西平，純度>98.0%，美國Apexbio公司)；神經元基礎培養基，B-27添加劑(美國Gibco公司)；胎牛血清(美國Hyclone公司)；L-多聚賴氨酸、L-谷氨酰胺、4-羥乙基哌嗪乙磺酸、甘氨酸、胰蛋白酶、Panx-1抗體、甘油醛-3-磷酸脫氫酶(GAPDH)抗體、辣根過氧化物酶標記的二抗(美國Sigma公司)；細胞計數試劑盒(CCK-8，天津百螢生物科技有限公司)；末端脫氧核苷酸轉移酶介導的dUTP缺口末端標記測定法(TUNEL)凋亡檢測試劑盒(德國Merck公司)；膜聯蛋白V-異硫氰酸熒光素/碘化丙啶(Annexin V-FITC/PI)雙染凋亡檢測試劑盒(上海BestBio貝博生物)；Trizol試劑(美國Invitrogen公司)；二辛可寧酸(BCA)蛋白定量試劑盒(北京鼎國昌盛生物技術有限責任公司)；增強化學發光(ECL)試劑盒(美國Amersham Bioscience公司)；其他試劑均為國產或進口分析純。

1.3主要培養液的配制 種植培養液：神經元基礎培養基(90%)+ L-谷氨酰胺(0.2 mol/L)+胎牛血清(10%)+鏈霉素(100 mg/L)+青霉素(100 U/ml)；維持培養液：神經元基礎培養基(98%)+L-谷氨酰胺(0.2 mol/L)+B-27 添加劑(2%)+鏈霉素(100 mg/L)+青霉素(100 U/ml)；無鎂細胞培養液：氯化鉀(2.5 mmol/L)+氯化鈉(145 mmol/L)+氯化鈣(2 mmol/L)+甘氨酸(0.002 mmol/L)+4-羥乙基哌嗪乙磺酸(10 mmol/L)+葡萄糖(10 mmol/L)。

1.4主要儀器 低溫高速離心機(GS-15R，美國BECKMAN公司)；膜片鉗(EPC-10，德國NanionTechnologies)；CO2培養箱(HERAcell 240i，美國Thermofisher Scientific公司)；酶標儀(RT-6100，美國Rayto公司)；流式細胞儀(FACScan，美國BD公司)；電泳儀(PowerPac HV，美國BIO-RAD公司)；轉膜儀(VE-186，上海天能科技有限公司)；蛋白成像系統(ChemiDoc XRS，美國BIO-RAD公司)。

1.5與海馬神經元培養 取新生24 h內的SD大鼠乳鼠，體積分數75%乙醇消毒后斷頭取腦，置入裝有預冷的D-Hank液的玻璃皿中，鈍性分離雙側海馬，剝除腦膜、血管，剪碎約1 mm3的小塊，裝入15 ml的玻璃離心管中，加入5倍于腦組織塊的1.25 g/L胰蛋白酶，37℃恒溫水箱水浴15 min。吸除上層胰酶后，4 ml種植培養基終止消化，漂洗組織2 次，巴氏滴管輕輕吹打細胞約20次，1 000 r/min離心5 min，棄上清，在沉淀中加種植培養液6 ml，輕輕吹打幾次重懸，200目細胞篩過濾。臺盼藍染色，血細胞計數板計數活細胞，根據計數結果，以種植培養液調整細胞終濃度為1×109/L，種植于L-多聚賴氨酸包被的96孔板，37℃飽和濕度，5%CO2培養箱內進行培養。種板后10 h將培養液全量換成維持培養液，隨后每3 d 半量換液。

1.6海馬神經元鑒定 海馬神經元培養至第9天，以神經微絲免疫組化染色鑒定神經元，倒置顯微鏡下觀察神經元胞質內和軸突內棕黃色陽性顆粒。

1.7大鼠海馬神經元癲癇樣放電模型的建立及給藥 海馬神經元培養至第9天，隨機分為正常對照組，模型組和MK-801組。正常對照組更換為正常細胞的細胞培養液培養3 h后恢復維持培養液；模型組更換為無鎂細胞外液培養3 h后恢復維持培養液，采用EPC-10 膜片鉗系統進行全細胞模式的電壓鉗記錄海馬神經元動作電位變化，以檢測到頻發的動作電位發放表示模型建立成功〔8〕；MK-801組加入含10 μmol/L MK-801維持培養液預保護30 min〔9〕，更換為無鎂細胞培養液培養3 h 后恢復維持培養液。各組于37℃飽和濕度，5% CO2培養箱內繼續培養24 h。每組設6個平行孔。

1.8CCK-8檢測神經元細胞活力 實驗分組、模型建立及給藥同“1.7”。檢測過程參照CCK-8檢測試劑盒操作說明書進行。RT-6100酶標儀于450 nm波長處測定吸光度值(OD)。

1.9TUNEL法 采用TUNEL凋亡檢測試劑盒檢測神經元凋亡指數，嚴格按照試劑盒的說明書進行操作。熒光顯微鏡下觀察熒光變化，凋亡神經元核和(或)神經元碎片發出綠色熒光，未凋亡神經元(正常神經元)核發出藍色熒光。隨機選取10個高倍視野(200×)，記錄每個視野內的綠色熒光及藍色熒光神經元數，并計算凋亡率。凋亡率=(視野內凋亡神經元數/視野內神經元總數)×100%。

1.10流式細胞儀AnnexinV-FITC/PI雙染法 實驗分組，模型建立及給藥同“1.7”。各組1 200 r/min離心5 min，收集細胞，1 ml磷酸鹽緩沖液(PBS)沖洗2次，500 μl結合緩沖液重懸成單細胞懸液，依次加入Annexin V-FITC和碘化丙啶(Propidiumiodide)液各5 μl混勻，室溫避光反應15 min。1 h內以FACScan流式細胞儀檢測神經元細胞凋亡情況，計算凋亡率。凋亡率=右下象限的早期凋亡神經元百分率+右上象限的晚期凋亡神經元百分率。

1.11蛋白質印跡法(Western印跡)檢測神經元Panx-1的表達 收集分組培養的細胞，嚴格按照試劑盒說明書提取總蛋白，BCA法測定總蛋白濃度。取50 μg蛋白上樣后進行10%十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠(SDS-PAGE)電泳分離，當電泳完成后，電轉膜儀轉膜至0.45 μm聚偏氟乙烯(PVDF)膜上，5%脫脂奶粉封閉2 h。與Panx-1抗體(1∶500稀釋)，GAPDH抗體(1∶2 000稀釋)4℃孵育過夜，1×吐溫20 Tris鹽酸緩沖液(TBS-T)洗膜后加辣根過氧化物酶標記的二抗(1∶1 000稀釋)孵育2 h。ECL試劑顯色。ChemiDoc XRS蛋白成像系統對各組條帶進行灰度值計值。

1.12實時熒光定量PCR(Real Time-PCR)檢測神經元Panx-1 mRNA的表達 Trizol試劑提取總RNA，檢測RNA純度，按照Real Time-PCR試劑盒進行反轉錄反應，合成單鏈的cDNA。cDNA產物保存在-20℃。利用Pubmed查找相關基因序列，并利用引物合成軟件Primer Premier 5.0設計引物。Real Time-PCR反應體系：體積為20 μl；反應程序為：95℃預變性10 s，50℃退火15 s，72℃延伸20 s，共40個循環，最后72℃ 延伸5 min。每個樣本以內參基因GAPDH調整。2-ΔΔCT法定量分析。引物序列為：Panx-1，正義TCTGCTCCGACCTGAA，反義GAAGAGCGTGTAGATGACC，168 bp；GAPDH，正義GAGGGAAATCGTGCGTGAC，反義GCATCGGAACCGCTCATT，212 bp。

1.13統計學分析 采用SPSS17.0軟件進行單因素方差分析及LSD法檢驗。

2 結 果

2.1海馬神經元鑒定結果 神經元胞質內和軸突內有大量棕黃色陽性顆粒，表明培養獲得的海馬神經元純度相對較高。見圖1。

圖1 海馬神經元神經微絲免疫組化染色結果(神經微絲免疫組化染色，×100)

2.2CCK-8檢測結果 與正常對照組〔(100.00±0.00)%〕比較，模型組海馬神經元細胞活力〔(79.38±2.31)%〕顯著降低(P<0.05)，表明大鼠海馬神經元癲癇樣放電模型中存在神經元損傷；與模型組比較，MK-801組海馬神經元細胞活力〔(92.06±2.74)%〕顯著升高(P<0.05)，表明阻斷NMDA受體可減輕大鼠海馬神經元癲癇樣放電模型神經元損傷。

2.3NMDA受體阻斷對大鼠海馬神經元癲癇樣放電模型神經元凋亡的影響

2.3.1TUNEL染色檢測結果 與正常對照組〔(9.72±0.54)%〕比較，模型組海馬神經元凋亡指數〔(47.26±2.37)%〕顯著升高(P<0.05)；與模型組比較，MK-801組海馬神經元凋亡指數〔(23.76±2.11)%〕顯著降低(P<0.05)。見圖2。

圖2 各組神經元凋亡TUNEL染色結果(×200)

2.3.2AnnexinⅤ-FITC/PI雙染流式細胞術檢測結果 與正常對照組〔(8.31±0.62)%〕比較，模型組海馬神經元凋亡率〔(46.42±3.95)%〕顯著升高(P<0.05)；與模型組比較，MK-801組海馬神經元凋亡率〔(34.67±2.71)%〕顯著降低(P<0.05)。見圖3。

2.4NMDA受體阻斷對大鼠海馬神經元癲癇樣放電模型Panx-1表達的影響 與正常對照組(0.845±0.045)比較，模型組海馬神經元Panx-1表達(2.202±0.120)顯著升高(P<0.05)；與模型組比較，MK-801組海馬神經元Panx-1表達(0.996±0.052)顯著降低(P<0.05)。見圖4。

圖3 AnnexinⅤ-FITC/PI雙染流式細胞術結果

圖4 各組Panx-1表達Western印跡結果

2.5NMDA受體阻斷對大鼠海馬神經元癲癇樣放電模型神經元Panx-1 mRNA表達的影響 與正常對照組(0.347±0.028)比較，模型組海馬神經元Panx-1 mRNA表達(0.681±0.112)顯著升高(P<0.05)；與模型組比較，MK-801組海馬神經元Panx-1 mRNA表達(0.471±0.033)顯著降低(P<0.05)。

3 討 論

我國癲癇患病率為5‰，老年人癲癇的發生率居所有人群之首〔10，11〕。研究發現，NMDA受體與癲癇的關系非常密切〔12〕。NMDA受體是神經元中一種重要的配體依賴的電壓門控的選擇性鈣離子通道，由NR1亞單位與NR2亞單位(NR2A-NR2D)構成，因具有電壓依賴性的Mg2+阻斷特性及對鈣離子的高通透性這一特性，使得NMDA受體在興奮毒性表現重要的作用〔13〕。NMDA受體在全腦幾乎都有分布，主要在杏仁體、紋狀體、大腦皮質、海馬等部位分布最多〔14〕。當機體處于某些病理狀態，導致谷氨酸在細胞內的含量升高，引起NMDA受體過度激活，解除了內源性Mg2+的阻滯作用，過多的神經元的突觸后膜發生同步性去極化，發生持續性放電，最后引起癲癇的發生〔15〕。癲癇可表現為腦神經元異常放電〔16，17〕。本研究提示NMDA受體阻斷可抑制大鼠海馬神經元癲癇樣放電模型神經元損傷，發揮神經元保護作用。

Panx-1是新型縫隙連接蛋白Pannexin家族中的成員之一，可通過形成半通道來發揮作用，在炎癥、腫瘤、腦缺血、癲癇等病理過程具有重要的意義〔18〕。在海馬中，主要以椎體神經元中可見Panx-1表達，NMDA受體激活可觸發Panx-1通道開放，進而引起癲癇的發生〔19〕。降低Panx-1表達將對癲癇的治療產生有利影響。NMDA受體阻斷可以抑制大鼠海馬神經元癲癇樣放電模型神經元損傷，發揮神經元保護作用，并抑制神經元Panx-1表達。

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R742

A

1005-9202(2017)23-5752-04；

10.3969/j.issn.1005-9202.2017.23.004

黑龍江省衛生計生委科研課題(2016-382)；黑龍江省中醫藥科研項目(2HY16-019)；牡丹江市科學技術計劃項目(Z2016s0084)

畢鵬翔(1980-)，男，碩士，副主任醫師，主要從事癲癇及頭痛研究。

羅海龍(1977-)，男，碩士，副主任醫師，主要從事癲癇及腦血管病研究。

〔2016-12-25修回〕

(編輯 王一涵)