Smad3對高糖環境下足細胞凋亡的影響

哈麗達·木沙 瑪依拉·卡哈爾 玉山江·艾克木

(新疆醫科大學第一附屬醫院VIP內科，新疆 烏魯木齊 830054)

Smad3對高糖環境下足細胞凋亡的影響

哈麗達·木沙 瑪依拉·卡哈爾 玉山江·艾克木1

(新疆醫科大學第一附屬醫院VIP內科，新疆 烏魯木齊 830054)

目的探討果蠅Mad基因3哺乳動物類似基因(Smad3)對高糖環境下足細胞凋亡的影響。方法足細胞分為對照組、高糖組、干擾組，對照組、高糖組在實驗開始前轉染siRNA control，干擾組轉染Smad3 siRNA。高糖組、干擾組用含有25 mmol/L的D葡萄糖細胞培養液培養，對照組用含有5 mmol/L的D葡萄糖細胞培養液培養。Western印跡檢測Smad3、磷酸化的Smad3(p-Smad3)、酶切的含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶3(Cleaved Caspase-3)、B細胞淋巴瘤(Bcl)-2相關X蛋白(Bax)、Bcl/白血病-x基因長片段(Bcl-xl)水平，流式細胞術檢測細胞凋亡。結果高糖組細胞中Smad3水平與對照組相比無明顯差異(P>0.05),而p-Smad3水平明顯高于對照組(P<0.05)。干擾組細胞中Smad3、p-Smad3水平均明顯低于高糖組(P<0.05)。高糖組細胞凋亡率明顯高于對照組，干擾組明顯低于高糖組(均P<0.05)。高糖組Cleaved Caspase-3、Bax水平明顯高于對照組，Bcl-xl水平明顯低于對照組(均P<0.05)，干擾組Cleaved Caspase-3、Bax水平均明顯低于高糖組，Bcl-xl水平明顯高于高糖組(均P<0.05)。結論高糖環境下，足細胞中Smad3磷酸化水平升高，細胞凋亡增多，而下調Smad3可以抑制高糖誘導的足細胞凋亡，抑制Cleaved Caspase-3、Bax表達，促進Bcl-xl表達。

足細胞；Smad3；高糖；細胞凋亡

糖尿病腎病是一種糖尿病并發癥，以蛋白尿、腎功能減退為主要臨床特征，以系膜變寬、系膜細胞外基質聚集、系膜細胞彌漫性和結節狀增殖為主要病理變化〔1〕。研究顯示，腎小球濾過功能損傷是糖尿病腎病發生和發展的重要原因，足細胞作為腎小球濾過功能的關鍵組成部分在腎組織損傷中發揮重要作用〔2〕。足細胞附著在腎小球基底膜的外側，是一種終末分化細胞，具有極高的特異性，是腎小球濾過屏障中的重要組成部分〔3〕。果蠅Mad基因3哺乳動物類似基因(Smad3)是Smads蛋白家族中的成員之一，也是一種特異性的效應分子，能夠將細胞外的信號傳遞至細胞內〔4〕。研究顯示，Smad3能夠調控細胞的生長，并且參與高糖誘導的足細胞凋亡過程〔5〕。本研究在體外用高糖培養液培養足細胞，通過細胞轉染的方法探討Smad3在足細胞凋亡中的作用。

隨著我國社會和經濟的不斷發展，人們回歸自然、回歸傳統的欲望也更加明顯，在這樣的背景之下，現代酒類包裝設計人員必須在實際工作開展過程中避免對傳統文化元素的簡單模仿和復制，而應將這些元素與新型材料、新型生產技術等有效的結合起來，進而確保酒類產品包裝的進一步升華。本研究主要結合以下實例對陶瓷造型元素在現代酒器設計中的應用進行分析。

1 材料與方法

1.1一般材料 永生化足細胞為某實驗室保存。Smad3一抗、磷酸化的Smad3(p-Smad3)一抗為美國Abcam公司產品；酶切的含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶3(Cleaved Caspase-3)一抗、B細胞淋巴瘤(Bcl)-2相關X蛋白(Bax)一抗、Bcl/白血病-x基因長片段(Bcl-xl)一抗為美國CST公司產品；GAPDH一抗為美國GeneTex公司產品；Ⅰ型膠原酶、胰蛋白酶、重組γ-干擾素(γ-IFN)均為美國Sigma公司產品；鏈霉素、青霉素、(DMEM)F12均為美國Gibco公司產品；二喹啉甲酸(BCA)蛋白濃度檢測試劑盒為美國Thermo公司產品；細胞蛋白提取試劑盒為德國qiagen公司產品

1.2細胞培養 足細胞在33℃，5% CO2培養箱中培養，培養方法參照參考文獻〔6〕，在培養瓶或培養板的底部用0.1 mg/ml的Ⅰ型膠原酶預先處理1 h。取沒有分化的足細胞，懸浮在細胞培養液(含有10%胎牛血清、100 μg/ml鏈霉素、10 U/ml γ-IFN、100 U/ml青霉素的DMEM F12)中培養，傳代用含有0.25% 胰蛋白酶的消化液傳代。在實驗開始前將足細胞更換為不含有γ-IFN的細胞培養液誘導分化14 d后，用于后續實驗。

1.3細胞分組 足細胞分為對照組、高糖組、干擾組，其中對照組、高糖組在實驗開始前轉染siRNA control，干擾組細胞轉染Smad3 siRNA。實驗0 h時，高糖組、干擾組用含有25 mmol/L的D葡萄糖細胞培養液培養，對照組用含有5 mmol/L的D葡萄糖細胞培養液培養。

2.1高糖及細胞轉染對足細胞中Smad3水平的影響 高糖組細胞中Smad3水平(0.64±0.03)與對照組(0.65±0.06)相比無統計學差異(P>0.05)，而p-Smad3水平(0.68±0.05)明顯高于對照組(0.44±0.04，P<0.05)。干擾組細胞中Smad3、p-Smad3水平(0.31±0.02，0.29±0.03)均明顯低于高糖組(P<0.05)。見圖1。

沙三下亞段位于接近盆地基底的低部位。由于基底斷裂發育和斷裂的持續活動，將不斷地釋放構造應力，從而對與其緊鄰的、脆性較大的上覆碳酸鹽巖礫巖層進行改造，以致產生構造裂縫甚至小斷層（圖2）。高產井車66、車660井即位于盆地基底斷裂帶上。該斷裂帶近東西向延伸，斷層斷距小延伸較短，以至于在地震剖面上難以識別，但對儲層物性的影響卻是顯著的。因此，沿斷裂帶延伸方向應是油氣相對富集的地帶。

2.3Smad3對高糖環境下細胞中Cleaved Caspase-3、Bax、Bcl-xl水平的影響 高糖組Cleaved Caspase-3、Bax水平明顯高于對照組(P<0.05)，Bcl-xl水平明顯低于對照組(P<0.05)。干擾組Cleaved Caspase-3、Bax水平均明顯低于高糖組(P<0.05)，Bcl-xl水平明顯高于高糖組(P<0.05)。見圖2，表1。

糖尿病患者體內長期處于高糖狀態，而高糖狀態會導致足細胞損傷，導致蛋白漏出形成蛋白尿，而足細胞在蛋白尿的作用下損傷加重，可見足細胞在糖尿病腎病發生過程中發揮重要作用〔7〕。足細胞凋亡增多，數量急劇減少，造成足細胞的流動性增強，進而形成腎小球硬化和局灶粘連〔8〕。本研究結果顯示，高糖培養后的足細胞凋亡數目增多，證實了高糖能夠促進足細胞凋亡。

2 結 果

1.4細胞轉染 取足細胞，培養至對數期后，加入胰蛋白酶消化細胞，800 r/min離心10 min，將上清液吸除后用磷酸鹽緩沖液(PBS)洗滌細胞沉淀2次，把細胞濃度調整為3×105個/ml，按照每孔加入2 ml細胞懸浮液種植到6孔板中，觀察細胞密度為60%進行轉染。用不含血清的培養液將Smad3 siRNA、siRNA control稀釋后，孵育20 min，記為A混合液。用不含血清的細胞培養液與轉染試劑Lip2000混合后，記為B混合液。把A液和B液混合后，加入細胞中孵育6 h，按照對照組、高糖組、干擾組分組更換細胞培養液，培養48 h，用于后續檢測。

2.2Smad3對高糖誘導細胞凋亡的影響 高糖組細胞凋亡率(28.15%±3.14%)明顯高于對照組(8.95%±0.82%，P<0.05)，干擾組(14.28%±1.73%)明顯低于高糖組(P<0.05)。

1.6流式細胞術檢測細胞凋亡 取1.4中對照組、高糖組、干擾組細胞，胰蛋白酶消化后，加入4℃預冷的PBS，收集1×106個細胞，用400 μl緩沖液懸浮后，分別加入5 μl 碘化丙啶(PI)和5 μl 膜聯蛋白V-FITC(Annexin V-FITC)，放在避光環境中，室溫反應20 min，再加入200 μl緩沖液，流式細胞儀測定細胞凋亡。

1.5Western印跡檢測細胞中Smad3、p-Smad3、Cleaved Caspase-3、Bax、Bcl-xl水平 取1.4中對照組、高糖組、干擾組細胞，加入細胞裂解液，在冰上裂解20 min，轉移至離心管中，12 000 r/min，4℃離心10 min。用BCA蛋白濃度檢測試劑盒檢測蛋白濃度。將蛋白樣品與5倍上樣緩沖液以4∶1的比例混合，100℃煮沸3 min使蛋白變性。每孔加入40 μg的蛋白樣品進行蛋白電泳(5%濃縮膠，10%分離膠)。80 V電壓電泳30 min后，觀察溴酚藍達到分離膠時，把電壓調整到120 V繼續電泳。電泳結束后，在100 V電壓，4℃轉膜90 min，將蛋白轉移至硝酸纖維素膜上。取出硝酸纖維素膜，放在5%脫脂奶粉中，37℃孵育60 min。與一抗(Smad3稀釋1 000倍、p-Smad3稀釋800倍、Cleaved Caspase-3稀釋1 000倍、Bax稀釋1 000倍、Bcl-xl稀釋1 000倍)4℃孵育過夜后，加入3 000倍稀釋的二抗室溫孵育60 min，顯色，以GAPDH為內參，用Bandscan 5.0分析蛋白水平。

圖1 Western印跡檢測各組細胞中Smad3水平

圖2 Western印跡檢測Cleaved Caspase-3、Bax、Bcl-xl水平

表1 各組細胞中Cleaved Caspase-3、Bax、Bcl-xl水平比較

與對照組比較：1)P<0.05；與高糖組比較：2)P<0.05

3 討 論

1.7統計學分析 采用SPSS21.0軟件進行單因素方差分析、LSD-t檢驗。

Smads是近年來發現的蛋白，在肺泡上皮細胞、腫瘤細胞、足細胞等多種細胞中廣泛表達，且與胚胎發育、組織生成、骨骼重建等有關〔9〕。Smads還參與肺組織纖維化、心肌梗死、癌癥發生、肺阻塞等疾病發生，后續的研究報道，Smads與糖尿病腎病的發生有關，在腎小管上皮細胞、足細胞中均有不同程度的表達，糖尿病腎病患者中Smad3水平升高，且能夠促進腎組織的纖維化〔10〕。李桂英〔11〕在研究骨形態蛋白在高糖環境下足細胞中的作用時發現，Smad3參與足細胞凋亡過程。正常情況下，Smad3以非活化的形式存在，當受到外界信號刺激后，Smad3磷酸化后生成p-Smad3發揮其生物學功能〔12〕。本研究結果顯示，高糖刺激后的Smad3磷酸化水平升高，說明Smad3參與糖尿病腎病的發生，Smad3下調可以抑制高糖誘導的足細胞凋亡。

綜上，以鉑類為基礎的3種化療方案均能有效控制乳腺癌，具有較好的臨床療效，均可以作為臨床上治療晚期TNBC的方案選擇。

對平板劃線的單菌落進行形態觀察。革蘭氏染色包括初染、媒染、脫色、復染等4個步驟，具體操作步驟見文獻[7]。

細胞凋亡的發生與細胞內基因的轉錄有關，是細胞維持內環境穩定的過程，也是一個細胞主動調控的過程〔13〕。目前對于細胞凋亡的作用機制尚不十分明確，Bcl-2蛋白家族參與細胞凋亡過程，含有多個成員，這些成員在細胞凋亡過程中發揮的作用不同，Bax能夠促進細胞凋亡的發生，屬于促凋亡蛋白；而Bcl-xl抑制細胞凋亡的發生，屬于抗凋亡蛋白〔14〕。Caspase蛋白家族參與細胞凋亡，其激活后引發的級聯反應能夠促進細胞凋亡的發生，Caspase-3是一種凋亡執行因子，正常狀態下以非活化的酶原形式存在，蛋白受到上游信號因子作用后，可以形成Cleaved Caspase-3促進細胞凋亡，Caspase-3的活化標志著細胞凋亡進入不可逆的階段〔15〕。研究表明，Caspase蛋白家族、Bcl-2蛋白家族均參與足細胞的凋亡過程〔16〕。本研究結果顯示，下調Smad3可以部分拮抗高糖的作用，下調Smad3可以通過作用于Cleaved Caspase-3、Bax、Bcl-xl抑制高糖誘導的足細胞凋亡。

1李惠秀,曹文富.糖尿病腎病發病機制及治療進展〔J〕.重慶醫學,2013；42(21)：2545-7.

2Wang X,Liu J,Zhen J,etal.Histone deacetylase 4 selectively contributes to podocyte injury in diabetic nephropathy〔J〕.Kidney Int,2014；86(4)：712-25.

3Du P,Fan B,Han H,etal.NOD2 promotes renal injury by exacerbating inflammation and podocyte insulin resistance in diabetic nephropathy〔J〕.Kidney Int,2013；84(2)：265-76.

4Yang H,Wang L,Zhao J,etal.TGF-β-activated SMAD3/4 complex transcriptionally upregulates N-cadherin expression in non-small cell lung cancer〔J〕.Lung Cancer,2015；87(3)：249-57.

5Sun YBY,Qu X,Howard V,etal.Smad3 deficiency protects mice from obesity-induced podocyte injury that precedes insulin resistance〔J〕.Kidney Int,2015；88(2)：286-98.

6Yu L,Lin Q,Feng J,etal.Inhibition of nephrin activation by c-mip through Csk-Cbp-Fyn axis plays a critical role in angiotensin Ⅱ-induced podocyte damage〔J〕.Cell Signal,2013；25(3)：581-8.

7You H,Gao T,Raup-Konsavage WM,etal.Podocyte-specific chemokine (CC motif) receptor 2 overexpression mediates diabetic renal injury in mice〔J〕.Kidney Int,2017;91(3)：671-82.

8Chen J,Chen JK,Harris RC.EGF receptor deletion in podocytes attenuates diabetic nephropathy〔J〕.J Am Soc Nephrol,2015;26(5)：1115-25.

9Dong X,Zhang C,Ma S,etal.High concentrations of mast cell chymase facilitate the transduction of the transforming growth factor-β1/Smads signaling pathway in skin fibroblasts〔J〕.Exp Ther Med,2015;9(3)：955-60.

10賈會玉,李 莉,呂 磊,等.基于 TGF-β1/Smads 信號通路探討丹蛭降糖膠囊對大鼠糖尿病腎病的防治作用〔J〕.中國藥理學通報,2015；31(11)：99.

11李桂英.Gremlin1 在高糖環境足細胞損傷中的作用及機制研究〔D〕.石家莊：河北醫科大學,2013.

12Yan YM,Ai J,Zhou LL,etal.Lingzhiols,unprecedented rotary door-shaped meroterpenoids as potent and selective inhibitors of p-Smad3 from Ganoderma lucidum〔J〕.Org Lett,2013;15(21)：5488-91.

13Zhang SS,Wu Z,Zhang Z,etal.Glucagon-like peptide-1 inhibits the receptor for advanced glycation endproducts to prevent podocyte apoptosis induced by advanced oxidative protein products〔J〕.Biochem Biophys Res Commun,2017;482(4)：1413-9.

14Peixoto EB,Papadimitriou A,Teixeira DA,etal.Reduced LRP6 expression and increase in the interaction of GSK3β with p53 contribute to podocyte apoptosis in diabetes mellitus and are prevented by green tea〔J〕.J Nut Biochem,2015;26(4)：416-30.

15庫亞萍,周盛年.丁苯酞注射液對大鼠局灶性腦缺血再灌注損傷的保護作用及半胱氨酸蛋白酶-3 表達的影響〔J〕.中國老年學雜志,2017;37(5)：1087-9.

16Paeng J,Chang JH,Lee SH,etal.Enhanced glycogen synthase kinase-3β activity mediates podocyte apoptosis under diabetic conditions〔J〕.Apoptosis,2014;19(12)：1678-90.

R587.2

A

1005-9202(2017)23-5763-03；

10.3969/j.issn.1005-9202.2017.23.008

新疆維吾爾自治區科技攻關和重點科技項目(201233398)

1 新疆醫科大學附屬中醫醫院干一科

玉山江·艾克木(1968-)，男，碩士，主任醫師，主要從事糖尿病及其并發癥研究。

哈麗達·木沙(1975-)，女，碩士，副主任醫師，主要從事糖尿病及其并發癥研究。

〔2017-06-15修回〕

(編輯 滕欣航)