葒草苷和木犀草素對人紅細胞自然老化的保護作用

王樹林 王曉茹 曹欣欣 王書華

(河北北方學院藥學系，河北 張家口 075000)

葒草苷和木犀草素對人紅細胞自然老化的保護作用

王樹林1王曉茹 曹欣欣 王書華

(河北北方學院藥學系，河北 張家口 075000)

目的探討葒草苷和木犀草素對人紅細胞自然老化的保護作用及構效關系。方法采用健康成年人去白細胞抗凝血制成紅細胞懸浮液，建立自然老化模型。測定紅細胞溶血度，抗氧化酶系及腺苷三磷酸酶(ATPase)活性，丙二醛(MDA)濃度。通過SDS-聚丙烯酰胺凝膠(SDS-PAGE)電泳分析損傷紅細胞膜蛋白變化，采用掃描電鏡和透射電鏡觀察紅細胞形態及紅細胞膜骨架超微結構。結果葒草苷、木犀草素均能較顯著抑制紅細胞溶血，保護抗氧化酶活性及ATPase活性，同時葒草苷、木犀草素還能顯著降低MDA含量(P<0.05,P<0.01)，對紅細胞膜蛋白具有保護作用，明顯改善紅細胞形態及超微結構。結論葒草苷和木犀草素對人紅細胞自然老化的保護作用是通過直接對抗氧自由基損傷和保護抗氧化酶系活性及紅細胞結構功能的完整性而實現的。

葒草苷；木犀草素；紅細胞；自然老化

紅細胞膜富含不飽和脂類及鐵，最易遭受氧自由基氧化損傷〔1〕。葒草苷屬黃酮碳苷類〔2〕，其體外具有清除羥基自由基、1，1-二苯基-2-三硝基苯肼能力及對紅細胞溶血的保護作用〔3〕，體內對D-半乳糖致衰老小鼠組織細胞膜的轉運能力的改善是通過抗氧化活性來實現的〔4〕。木犀草素屬黃酮苷元類〔5〕，具有保護心血管、抗氧化、抗炎、抗腫瘤等藥理作用〔6～8〕。葒草苷和木犀草素結構相似，僅在葒草苷A環C-8位上相差一個葡萄糖基，那么這一結構差異對葒草苷和木犀草素抗氧化活性又有何影響呢？本研究以人紅細胞為研究對象，采用自然老化紅細胞模型，以維生素C(VC)為陽性對照，比較葒草苷和木犀草素對人紅細胞的保護作用并闡明其作用機制。

1 材料與方法

1.1儀器與試劑 UV-9100紫外可見分光光度計：北京萊伯泰科儀器有限公司；S-3400N掃描電鏡、H-7500透射電鏡、E-1010離子濺射裝置：日本日立；新鮮去白細胞抗凝血，張家口市中心血站提供；葒草苷，自制，純度達到98%以上；木犀草素，天津一方科技有限公司；VC，天津市化學試劑一廠；丙二醛(MDA)、總超氧化物歧化酶(T-SOD)、三磷酸腺苷(ATP)、過氧化氫酶(CAT)、甘谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-Px)、唾液酸(SA)測定試劑盒均購買自南京建成生物工程研究所，批號分別為：20120417、20120417、20120420、20120419、20120417、20120419。

1.2紅細胞懸液的配制 紅細胞取自健康人靜脈血，離心除去血漿和白細胞。用磷酸緩沖鹽溶液(PBS)洗滌3次，配制2%的紅細胞懸液。

1.3自然老化模型建立〔9〕4 ml 2%的紅細胞懸液于37℃電熱恒溫培養箱中孵育0，12，24，48，72 h，取反應液，分別用生理鹽水和蒸餾水稀釋10倍，離心(4℃，2 500 r/min，10 min)，412 nm處測定吸光度值，檢測溶血率，確定最佳老化時間。

1.4分組與給藥 葒草苷和木犀草素溶液的配制：葒草苷和木犀草素用二甲基亞砜(DMSO)溶解后，再加甲醇(CH3OH)稀釋。實驗分為模型組、正常組、VC組(20 μg/ml)、葒草苷和木犀草素(40，20，10 μg/ml)各三個劑量組，給藥組給藥后37℃孵育48 h。

1.5測定指標

1.5.1溶血率 取試管紅細胞反應液，分別用生理鹽水和蒸餾水稀釋5倍，412 nm處測定吸光度值，檢測溶血率。

1.5.2抗氧化酶系及腺苷三磷酸酶(ATPase)活性、MDA濃度 測定SOD、CAT、GSH-Px、ATPase、唾液酸(SA)和MDA；測定方法根據試劑盒說明操作。

1.5.3膜蛋白變化觀察 紅細胞膜的制備：紅細胞反應液離心(2 500 r/min，10 min)，按1∶30的體積比與預冷的低滲磷酸鹽緩沖液(5 mmol/L Na2HPO4，0.1 mmol/L PMSF，pH8.0)混合，置于4℃冰箱中溶血1 h。然后離心(4℃，15 000 r/min，20 min)棄上清后用低滲磷酸鹽緩沖液洗3次，離心(4℃，19 000 r/min，20 min)，即可得到乳白色的紅細胞膜蛋白樣品。將所得紅細胞膜蛋白定量，然后與等滲PBS混合，使蛋白終濃度為1 mg/ml，放在-80℃冰箱。將紅細胞膜進行SDS-PAGE分離后，用凝膠成像系統觀察、照相。

1.5.4紅細胞膜表面形態觀察 將自然老化的紅細胞分別與2%戊二醛以1∶100的比例混合，固定過夜，用PBS浸洗3遍，脫水干燥后放入E-1010離子濺射裝置噴金，S-3400N掃描電鏡觀察、拍照。

1.5.5膜骨架結構觀察 將自然老化的紅細胞膜與含2.5%(W/V)TritonX-100的5 mmol/L NaPi(pH7.0)溶液，以1∶4混合，0°C放置1 h。取混合液滴到銅網上，蒸餾水洗滌3次，1%的醋酸雙氧鈾負染5～10 s，濾紙吸干后用H-7500透射電鏡觀察紅細胞膜骨架結構。

1.6統計學方法 采用SPSS17.0統計學軟件進行t檢驗。

2 結 果

2.1紅細胞自然老化模型建立 紅細胞孵育0，12，24，48，72 h后，隨著孵育時間的延長溶血率逐漸增大〔(6.38±1.02)%、(11.35±2.43)%、(23.69±2.54)%、(37.58±2.44)%、(43.20±3.19)%〕。相鄰孵育時間點溶血率相比，除12、24、48 h之間差異顯著(P<0.01)，其余時間點均無差異。所以選48 h為紅細胞自然老化模型孵育時間。

2.2藥物對紅細胞自然老化溶血的影響 紅細胞自然老化后，出現嚴重的溶血現象，與正常組〔(6.38±1.02)%〕相比，模型組溶血率有顯著增高〔(37.58±2.44)%，P<0.01〕；與模型組相比，不同給藥組對自然老化引起的溶血有抑制作用且呈劑量依賴性(P<0.05，P<0.01)；葒草苷10，20 μg/ml濃度組〔(31.46±2.61)%、(26.81±2.18)%〕，抗溶血作用弱于10、20 μg/ml木犀草素組〔(27.11±1.67)%、(20.47±2.09)%，P<0.05，P<0.01〕，紅草苷與木犀草素40 μg/ml濃度組相比無顯著差異〔(13.25±2.25)%、(14.06±1.88)%，P>0.05〕；與VC組〔(12.88±2.37)%〕相比，葒草苷與木犀草素10，20 μg/ml濃度組抗溶血作用較弱，但差異顯著(P<0.05，P<0.01)，40 μg/ml濃度組與VC無顯著差異(P>0.05)。

2.3藥物對紅細胞自然老化抗氧化酶及ATPase、SA、MDA的影響 紅細胞自然老化后，抗氧化酶及ATPase活性、SA含量顯著下降，MDA含量明顯升高，與正常組相比有顯著差異(P<0.01)；給予藥物預處理后，各指標均有不同程度恢復，與模型組相比有顯著差異(P<0.05，P<0.01)，且在一定范圍內與濃度呈正相關；與相同濃度的木犀草素相比，葒草苷10，20 μg/ml濃度組抗氧化能力弱于木犀草素同濃度組(P<0.05，P<0.01)，而40 μg/ml葒草苷和木犀草素濃度組無顯著差異(P>0.05)；與VC相比，葒草苷與木犀草素10，20 μg/ml濃度組抗氧化能力弱于VC 20 μg/ml濃度組(P<0.05，P<0.01)，40 μg/ml濃度組無差異(P>0.05)。見表1。

表1 藥物對紅細胞自然老化抗氧化酶及ATPase、SA、MDA水平的影響

與正常組比較：1)P<0.01；與模型組比較：2)P<0.05，3)P<0.01；與同濃度木犀草素組比較：4)P<0.05，5)P<0.01；與VC組比較：6)P<0.05，7)P<0.01

2.4SDS-PAGE電泳結果 紅細胞自然老化后，血影蛋白和錨定蛋白發生聚集，帶4.1a/帶4.1b增大。給予藥物預處理后，各給藥組均能抑制血影蛋白、錨定蛋白條帶聚集，并使帶4.1a/帶4.1b降低，見圖1。

2.5掃描電鏡觀察結果 正常紅細胞呈同心型雙凹圓盤狀結構，表面光滑、飽滿，基本無異常細胞。自然老化后，紅細胞皺縮，體積減少，并發現有囊泡溢出。給予藥物預處理后，細胞表面趨于平滑，皺縮減少，體積逐漸恢復正常，囊泡明顯減少，以上變化與濃度呈正相關，見圖2。

2.6透射電鏡觀察結果 正常紅細胞膜骨架結構清晰，網絡狀結構明顯且網眼均勻、一致。老化后，網絡狀結構破壞，SP4和J點模糊難辨，給予藥物預處理后，可以看到隨藥物濃度升高，對膜骨架的保護作用逐漸增強，葒草苷40 μg/ml組、木犀草素20 μg/ml組、VC組作用最為顯著，但與正常組相比，仍存在一定差距。見圖3。

A:模型組;B:正常組;C:40 μg/ml木犀草素組;D:20 μg/ml木犀草素組；E:10 μg/ml木犀草素組;M:Marker;F:20 μg/ml VC組;G:10 μg/ml葒草苷組;H:20 μg/ml葒草苷組;I:40 μg/ml葒草苷組圖1 SDS-PAGE檢測紅細胞膜變化

圖2 掃描電鏡各組紅細胞自然老化結果(×2 500)

圖3 透射電鏡觀察各組紅細胞自然老化結果(×30 000)

3 討 論

本研究顯示，紅細胞孵育48 h后，抗氧化酶、SA、ATPase活性下降，MDA含量升高，其機制可能是因為紅細胞在人體血液中含量最多，其運動循環代謝主要通過多種酶完成，但當紅細胞發生衰老時，抗氧化劑攝入減少導致抗氧化酶類活性降低，使多余自由基不能及時被清除，造成脂質過氧化損傷；在老化過程中，ATP生成減少，使能量代謝受阻，最終導致機體的嚴重損壞甚至壞死〔10〕。SOD、CAT、GSH-Px是機體內主要的抗氧化劑，它們相互保護、相互協同保護了機體免受活性氧的破壞〔11〕。一旦這個防御體系被破壞，機體內自由基的動態平衡將被打破，導致大量脂質過氧化物產生，其中最重要的是MDA，過量MDA造成細胞膜損傷〔12〕，另外，脂質過氧化損傷會造成ATPase活性降低，影響細胞變形性和完整性〔13〕。SA位于紅細胞膜的糖蛋白與糖脂糖鏈末端，具有抗病毒、抗腫瘤、抗老年癡呆等生理活性，對研究機體老化機制具有重要意義〔14〕。本實驗結果顯示，葒草苷能夠提高SA含量，并與濃度呈正相關，與Oldenborg等〔15〕研究結果一致。

紅細胞膜由脂質雙分子層及附著于內表面的膜骨架構成，膜骨架系統(六邊網狀的骨架結構)主要由血影蛋白、帶4.1蛋白、肌動蛋白、加合蛋白和錨定蛋白等構成，血影蛋白所占比例最大(約55%)，一旦發生異常，就會使脂質雙分子層與膜蛋白形成囊泡，脫離骨架，最終導致紅細胞形態、結構和功能改變，影響紅細胞正常生理功能〔16〕。本實驗結果顯示，給予藥物處理后，膜蛋白、表面形態及骨架結構均得到一定程度的恢復，且恢復程度與劑量呈正相關。李靜〔17〕研究了銀杏葉提取物對人紅細胞氧化損傷及自然老化的影響，證明銀杏提取物不僅可有效保護膜蛋白，防止其因發生聚集，脫落而減少或消失，還對膜骨架及紅細胞膜表面形態均有一定的保護作用，且有一定的劑量關系，與本實驗結果相一致。本研究黃酮類化合物上的酚羥基有利于抗氧化，清除自由基〔18〕，研究中葒草苷與木犀草素B環上均有鄰二酚羥基，有較強的抗氧化能力，但葒草苷10，20 μg/ml濃度組的對老化紅細胞的保護弱于木犀草素同濃度組，40 μg/ml濃度組作用相當，可能原因是葒草苷A環8位上的糖基化造成空間位阻，使其抗氧化活性下降，這與文獻〔19〕結果相一致。

葒草苷和木犀草素對人紅細胞自然老化的保護作用是通過直接對抗氧自由基損傷和保護抗氧化酶系活性以及紅細胞結構功能的完整性而實現的。在抗氧化藥物構效選擇上，10，20 μg/ml濃度組木犀草素的活性比葒草苷強，葒草苷A環上空間位阻影響了葒草苷的抗氧化活性。

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R285

A

1005-9202(2017)23-5779-04；

10.3969/j.issn.1005-9202.2017.23.013

河北省研究生創新資助項目(2015-203)；張家口市科技局(11110015D)；河北北方學院重大項目(ZD1314)

1 陽泉煤業(集團)有限責任公司總醫院藥學部

王書華(1965-)，女，教授，碩士生導師，主要從事中藥有效成分的提取及藥理研究。

王樹林(1989-)，女，碩士，主要從事中藥有效成分的提取及藥理研究。

〔2016-10-13修回〕

(編輯 苑云杰/曹夢園)