AMP依賴的蛋白激酶及PI3K/Akt信號途徑在頸動脈狹窄形成過程中的變化

肖 穎 陳 實 余文珍 張永亮 劉盛澤

(廈門大學附屬福州市第二醫院病理科，福建 福州 350007)

AMP依賴的蛋白激酶及PI3K/Akt信號途徑在頸動脈狹窄形成過程中的變化

肖 穎 陳 實1余文珍2張永亮1劉盛澤1

(廈門大學附屬福州市第二醫院病理科，福建 福州 350007)

目的觀察AMP依賴的蛋白激酶(AMPK)及PI3K/Akt信號途徑在頸動脈狹窄形成過程中的變化。方法取SD大鼠經高脂喂養1個月后行頸總動脈球囊損傷術作為模型組(n=24)，繼續喂養14 d 后取損傷側頸總動脈，行HE染色觀測血管內皮損傷及內膜增生情況，應用熒光定量PCR法檢測AMPK及PI3K/Akt mRNA水平，用Western印跡檢測p-AMPK、PI3K、p-Akt蛋白水平，另取8只正常SD大鼠作為假手術組。結果模型組大鼠血管內膜增生明顯、管壁變厚；AMPK/PI3K/Akt mRNA及蛋白水平較假手術組顯著下降(P<0.01)。結論AMPK/PI3K/Akt在頸動脈狹窄的病理生理進程中起到一定的作用。

頸動脈狹窄；AMP依賴的蛋白激酶；PI3K；Akt

頸動脈狹窄是導致缺血性腦血管病的重要原因之一，可引起腦卒中等疾病并導致相應的臨床癥狀。頸動脈狹窄的形成機制比較復雜，頸動脈內膜粥樣斑塊的形成及血管內膜的損傷是其發生的重要病因〔1〕。有報道AMP依賴的蛋白激酶(AMPK)參與了缺血后血管重建，AMPK是細胞的能量變化感受器，參與調節多種信號通路，如PI3K/Akt信號通路等。本文擬通過建立頸動脈狹窄動物模型，探討AMPK/PI3K/Akt途徑在頸動脈狹窄形成過程中的可能機制。

1 材料與方法

1.1實驗動物 清潔級雄性SD大鼠32只，平均體質量(200±20)g，購自上海斯萊克實驗動物有限公司，生產許可證：SCXK(滬)2007-0005。

1.2儀器與試劑 手術顯微鏡，美國World precision instruments；PCR儀，ABI 7500型；PCR引物，生工生物工程(上海)有限公司合成；p-AMPK、PI3K、p-Akt抗體，CST；二喹啉酸(BCA)蛋白試劑盒，上海碧云天生物科技有限公司。

1.3分組與處理 將大鼠隨機分為假手術組8只，無高脂喂養，僅切開頸部皮膚分離基層無球囊損傷，模型組24只。模型組大鼠予高脂飼料，自制配方:25%豬油,2%膽固醇,0.1%膽酸鈉，72.9%基礎飼料，喂養1個月，行頸動脈球囊損傷術，術后在水瓶中加入芐星青霉素以通過飲水預防感染，并單籠喂養。全程觀察大鼠的精神面貌、飲食及體重變化。14 d后禁食不禁水處死大鼠，取術側頸總動脈段，生理鹽水洗凈，取部分(假手術組2只，模型組8只)頸總動脈段放入10%中性甲醛中固定，余下頸動脈段取出后迅速置于液氮中再轉存-70℃備用。大鼠頸動脈球囊損傷模型制備參照文獻等〔2〕方法稍進行改良，禁食12 h，麻醉后取左斜切位，在手術顯微鏡下分離血管直至頸總動脈分叉，在頸外動脈遠心端下留線結扎，頸總動脈近心端及頸內動脈用動脈夾夾住，將球囊導管從頸外動脈近心端插入至頸總動脈起始部。注入約0.1 ml 生理鹽水使球囊充盈，然后緩慢來回推拉球囊導管以損傷頸動脈血管內皮。

1.4血管內膜病理形態學觀察 常規石蠟包埋切片后，行蘇木精-伊紅(HE)染色，在光學顯微鏡下觀察血管內皮損傷程度、管壁厚度、內膜增生等情況。

1.5實時熒光定量PCR法檢測組織AMPK、PI3K、Akt mRNA的表達 按Trizol法提取各組大鼠頸動脈總RNA，并參照逆轉錄擴增試劑盒操作程序進行cDNA合成。擴增條件為：95℃ 2 min變性，95℃，10 s，60℃，30 s，70℃，30 s，擴增40個循環，獲得各樣本待測基因的CT值，各組間相對基因表達用2-△△CT表示。采用ACTB作為內參照，引物序列：ACTB正義鏈5′：CTGCGGGTATCCATGAGA3′,反義鏈5′:TACCACCACTGAGAACGATG3′;AMPK-G8正義鏈5′：ATGTCCTGCTTGATGCACAC3′；反義鏈5′CTTCTGGTGCAGCATAGTTG3′;PI3K-G9正義鏈5′：TTTGGATAACTTGCTTGTGAGATT3′；反義鏈5′CGACTTGCCTATTCAGGTGCTT3′；Akt-G10正義鏈5′：GCTTCTTTGCCGGTATCGTGT3′；反義鏈5′GCTGTCATCTTGGTCAGGTGGT3′。

1.6Western印跡法檢測組織p-AMPK、PI3K、p-Akt蛋白表達 將組織加入蛋白裂解液冰浴條件下勻漿，并按BCA法進行蛋白定量。配十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠(SDS-PAGE)電泳膠，后將蛋白樣品用此凝膠電泳進行分離，再轉移到聚二偏氟乙烯(PVDF)膜上,用含5% 脫脂奶粉封閉液室溫輕搖漂洗PVDF 膜1 h，將膜放入大小適宜的自封袋中，分別加入1∶(500～1 000)稀釋一抗37℃1 h，取出PVDF膜，用T-TBS 液洗3次，每次10 min，后加入1∶1 000稀釋的辣根過氧化物酶標記的二抗。室溫2 h，取出PVDF膜，用T-TBS 液洗3次，每次10 min，用電光學發光法(ECL)顯色，曝光顯影。以β-actin蛋白為內參照，計算各組p-AMPK、PI3K、p-AKT的相對表達量。

1.7統計學方法 采用 SPSS17.0軟件進行單因素方差分析。

2 結 果

2.1各組一般情況觀察 假手術組大鼠未見有明顯異常改變。模型組大鼠術后前3 d大鼠精神較差，后稍有好轉，但毛發欠光澤，體重增長緩慢，未見感染死亡現象。

2.2各組損傷側頸動脈病理形態學觀察 光鏡下可見，假手術組血管壁完整，內、外彈力板完整連續，內膜光滑，中膜未見增厚；模型組頸動脈內皮細胞脫落，內膜明顯不規則增生，增生的細胞核大、胞質豐富，類似平滑肌細胞，中膜增厚較明顯。見圖1。

圖1 各組頸動脈病理變化(HE，×400)

2.3各組頸動脈AMPK、PI3K、Akt mRNA表達比較 與假手術組比較，模型組AMPK、PI3K、Akt mRNA水平顯著降低(P<0.01)。見表1。

表1 各組AMPK、PI3K、Akt mRNA相對表達比較

2.4各組頸動脈p-AMPK、PI3K、p-Akt蛋白表達比較 模型組頸動脈球囊損傷術后p-AMPK、PI3K及p-Akt 蛋白表達較假手術組明顯減少(P<0.05)。見圖2、表2。

圖2 各組p-AMPK、PI3K及p-Akt 蛋白表達

表2 各組p-AMPK、PI3K及p-Akt 蛋白表達比較

3 討 論

AMPK是一種細胞能量感受器，其激活可以調控細胞增殖、凋亡、遷移及腫瘤浸潤等；最近研究表明其在血管重建中也起到了重要的作用〔3,4〕。AMPK激活后可以通過AMPK-內皮型一氧化氮合酶(eNOS)-一氧化氮(NO)信號途徑影響血管功能。內皮源性NO是血管生物學的一個關鍵分子，可促進血管內皮細胞增殖、降低血管張力和內皮細胞黏附〔5〕。研究表明AMPK的活化可以維持正常血管結構，AMPK失活和血管內皮損傷密切相關，其表達缺失會導致血管內膜病變，且與動脈粥樣硬化、高血壓等疾病相關〔6〕；而當其激活后可導致炎癥細胞對血管內皮的黏附減少，脂質積累減少，防止脂質氧化引起的炎癥擴散，刺激負責細胞抗氧化防御基因的表達，促進NO的形成，并認為AMPK是血管內膜增生和再狹窄的治療目標〔7，8〕。Ki等〔9〕對用AMPK激動劑對PDGF誘導血管內膜細胞增生AMPK可以抑制血管內膜的增生。通過激活AMPK可以有效地抑制血管平滑肌細胞的增殖〔8〕。AMPK也可以通過mTOR、p53、PI3K三條通路參與細胞的增殖、凋亡從而調節血管內膜〔10〕。

PI3K/Akt信號通路也參與細胞增殖與分化、凋亡等多種生理和病理過程。研究表明PI3K激動劑能夠通過提高Akt 和eNOS的磷酸化水平從而有效地激活 PI3K/Akt/eNOS信號途徑，而PI3K的抑制劑則抑制eNOS的活性；并且PI3K/Akt信號通路能夠對血管內皮細胞的增殖和分化中起到重要的作用，其主要通過激活eNOS發揮作用〔11～13〕。PI3K/Akt也能作用于血小板源生長因子(PDGF)從而調節血管平滑肌細胞增殖、遷移及細胞凋亡。PI3K/Ak與AMPK相互之間存在廣泛的調整作用，兩者之間主要表現為相互協同合作而不是相互拮抗〔14〕。研究表明AMPK通過復雜的方式調控PI3K 信號通路，刺激該信號通路的活化，同樣AKt也能反饋調整AMPK的磷酸化過程〔15〕。AMPK和PI3K/AKt均能通過激活eNOS從而調控血管平滑肌細胞的增殖。有研究顯示AMPK和PI3K/AKt在前列腺癌的細胞生長過程中，這兩個信號通路相互作用對前列腺癌生長發生作用〔16〕。AMPK和PI3K/AKt信號途徑對缺血預處理的心肌細胞有協同保護作用，但是它們之間的具體關聯機制有待進一步明確〔17〕。頸動脈再狹窄形成過程中兩者之間可能相互作用，共同影響血管內皮細胞的增殖和分化。

本研究顯示在頸動脈狹窄的形成過程中，AMPK/PI3K/AKt表現失活，可能與動脈內膜的增生、血管狹窄形成有關。進一步明確這些信號通路在頸動脈狹窄形成過程的機制及相互作用機制及如何通過調整這些信號通路對于有效預防頸動脈內膜狹窄有著積極的意義。

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R543.4

A

1005-9202(2017)23-5794-03；

10.3969/j.issn.1005-9202.2017.23.019

福州市科技計劃項目(No.2012-S-155-1)

1 廈門大學附屬福州市第二醫院神經外科

2 福建中醫藥大學中西醫結合學院

陳 實(1974-)，男，碩士，副主任醫師，主要從事腦血管病研究。

肖 穎(1970-)，男，副主任醫師，主要從事臨床病理學研究。

〔2016-10-13修回〕

(編輯 苑云杰/曹夢園)