腫瘤壞死因子相關凋亡誘導配體及其與5-Fu聯合用藥對T-24細胞生長的抑制作用

肖建華 董自強 游 艷

(三峽大學第一臨床醫學院泌尿外科 三峽大學泌尿外科研究所，湖北 宜昌 443003)

腫瘤壞死因子相關凋亡誘導配體及其與5-Fu聯合用藥對T-24細胞生長的抑制作用

肖建華 董自強 游 艷1

(三峽大學第一臨床醫學院泌尿外科 三峽大學泌尿外科研究所，湖北 宜昌 443003)

目的研究腫瘤壞死因子相關凋亡誘導配體(TRAIL)單獨應用及其與傳統化療藥物5-氟尿嘧啶(5-Fu)聯合應用對體外培養人膀胱腫瘤T-24細胞生物學行為影響及可能機制。方法倒置顯微鏡下觀察不同濃度TRAIL作用不同時間后T-24細胞形態變化；MTT法檢測不同濃度TRAIL單獨或10 ng/ml TRAIL聯合不同濃度5-Fu不同時間后T-24細胞生存率；流式細胞儀檢測T-24細胞凋亡率。結果TRAIL單獨應用時對T-24細胞生長抑制作用有限，顯微鏡下部分細胞出現形態學改變，作用72 h后1、300、1 000 ng/ml組細胞生存率分別(92.52±3.60)%，(84.63±5.93)%和(79.45±2.04)%；單用200、400、600、800及1 000 μmol/ml 5-Fu時細胞生長抑制率分別為(10.76±1.78)%、(14.17±2.75)%、(28.01±1.66)%、(20.17±1.68)%和(32.53±3.65)%，聯合10 ng/ml TRAIL處理后0、200、400、600、800及1 000 μmol/ml 5-Fu組細胞抑制率分別為分別為(3.85±0.88)%、(8.41±0.74)%、(16.39±2.72)%、(26.27±1.72)%、(28.99±3.36)%和(30.18±1.34)%；10、100、1 000 ng/ml TRAIL處理48 h后的細胞平均凋亡率為(3.75±0.31)%、(7.82±1.07)%、(7.78±3.15)%。結論TRAIL單用或聯合其他化療藥物對T24細胞生長抑制作用有限，同5-Fu聯合應用時不能明顯增加T-24細胞對5-Fu的敏感性。

TRAIL；T-24；聯合用藥；生長抑制

目前以手術治療為主的綜合治療是膀胱癌的主要治療方法。任何保留膀胱的膀胱癌手術均存在復發可能，所以術后需定期做膀胱鏡復查，化療以預防膀胱癌的復發。而化療藥物常為一些毒性較高的藥物，灌注后會出現諸如尿路刺激癥狀、血尿等藥物毒副作用及厭食、惡心等胃腸道并發癥，而即使早期膀胱腫瘤經尿道行腫瘤電切術后常規灌注化療其復發率依然高達50%以上〔1〕。腫瘤壞死因子相關凋亡誘導配體(TRAIL)為腫瘤壞死因子(TNF)超家族成員之一，參與身體自然防御，能誘導多種腫瘤細胞凋亡發生而對正常組織細胞的生長分化沒有影響。同時，其還能增加多種腫瘤細胞對常用傳統化療藥物的敏感性，或逆轉部分腫瘤細胞的耐藥性〔2〕，本文探討TRAIL及其同5-氟尿嘧啶(5-Fu)聯合應用對體外培養人膀胱癌T-24細胞生物學行為的影響。

1 材料和方法

1.1主要材料與試劑 TRAIL為美國Peprotech公司產品(貨號：310-04，規格：50 μg/瓶)，5-Fu(上海浩然生物技術有限公司)、RPMI1640干粉、胰蛋白酶(武漢谷歌生物科技有限公司)、胎牛血清(杭州四季青)、抗生素(青霉素、鏈霉素，華北制藥)、碳酸氫鈉(天津市科密歐化學試劑有限公司)、醫用級酒精(武漢市雪環醫用消毒用品有限公司)、臺盼藍(北京市華美公司)，二甲基亞砜(DMSO)為美國Sigma公司產品，ANNEXIN V-FITC/PI 雙染法細胞凋亡檢測試劑盒(北京四正柏生物科技有限公司)，人膀胱癌T-24細胞購自武漢大學中國典型培養物保藏中心。

1.2細胞培養 培養T-24細胞所用培養基采用其推薦的RPMI1640干粉溶于雙蒸水配制，具體方法參照說明書完成。細胞用25 ml玻璃培養瓶置于37℃，5% CO2培養箱中培養，觀察細胞的生長狀態，2～3 d更換新鮮培養液，待顯微鏡下見細胞生長旺盛，必要時行細胞傳代、凍存或收取細胞進行實驗，所有過程確保為無菌操作。

1.3藥物及試劑準備 不同濃度的TRAIL藥液：用去離子水將TRAIL藥物粉末溶解，然后用含有10%胎牛血清的RPMI1640培養液稀釋至1、3、10、30、100、300、1 000 ng/ml及其他所需工作濃度；不同濃度的5-Fu藥液：用高壓滅菌后的雙蒸水將藥物粉末溶解，然后用含有10%胎牛血清的RPMI1640培養液將其稀釋至200、400、600、800和1 000 μmol/ml。

1.4細胞形態觀察 不同濃度藥物作用期間定期觀察不同分組細胞培養瓶中細胞的生長速度，胞體、胞核形態，培養液的顏色等，直觀反映細胞生長狀況的各項指標以確保實驗順利進行；預定時間處理完成后借助光學顯微鏡觀察細胞生長抑制狀況，初步判斷其是否具有抑制人膀胱癌T-24細胞生長的作用。

1.5MTT法測定單用及聯合用藥時細胞生長抑制率 每96孔培養板上的加樣分調零孔(等體積培養液)、陰性對照、不同濃度的實驗藥物三部分。細胞用胰酶消化，配成細胞懸液后接種到96孔板(每孔2×104個細胞)，放入培養箱中培養；細胞貼壁后施加處理因素。在不同的培養板中分別加入不同濃度TRAIL和5-Fu藥液，每孔100 μl且每種濃度設置4個復孔；調零孔加入等體積的培養液，分別作用24，48和72 h。另分別配置不同濃度TRAIL和5-Fu混合藥液，使得混合后的藥液中5-Fu濃度分別為200、400、600、800、1 000 μmol/ml，而TRIAL濃度均為10 ng/ml。將混合藥液按上述方法加入培養孔，每種濃度設置4個復孔，分別作用24，48和72 h。

1.6流式細胞術檢測細胞凋亡率 將生長狀態良好的細胞用胰酶消化并配成細胞懸液，均勻種植到6孔培養板，設0、10、100、1 000 ng/ml四組。待其貼壁后進行換液，加入對應濃度的TRAIL藥液；將培養板放入細胞培養箱，培養24 h后棄去藥液，然后用胰酶消化細胞使其脫離培養板壁，用移液器吹打，轉入離心管，800 r/min離心5 min后棄去上清；用磷酸鹽緩沖液(PBS)反復洗滌三次，棄上清； 按ANNEXIN V-FITC/PI 雙染法細胞凋亡檢測試劑盒說明書配制緩沖液和染液，并對不同濃度藥物處理后的細胞進行染色，染色時間為15 min；將按預定程序處理后的細胞上流式細胞儀進行凋亡檢測。

1.7統計學方法 采用SPSS13.0軟件進行方差LSD法Tamhane法檢驗。

2 結 果

2.1不同濃度TRAIL作用后的細胞形態學觀察 陰性對照組細胞貼壁生長，狀態良好，呈梭形，生長速度快，培養液清亮。而經不同濃度TRAIL處理后細胞的生長則受到輕度抑制，隨著藥物濃度增加，藥物對細胞生長的抑制程度有一定的增加趨勢，細胞體積稍變小，部分細胞的梭形變為不規則形狀，部分貼壁細胞出現皺縮、變圓甚至脫落。見圖1。

圖1 不同濃度TRAIL處理24 h后T-24細胞的形態學觀察(×40)

2.2不同濃度TRAIL和5-Fu對T-24細胞的生長抑制作用 不同濃度TRAIL作用24 h后對T-24細胞生長抑制最明顯的為100 ng/ml組，所有濃度組細胞生存率均在80%以上；作用48 h后以1 000 ng/ml組對T-24細胞生長抑制程度最大。同一作用時間內，隨著TRAIL 藥物濃度的不斷上升，細胞生長抑制程度呈現出逐漸上升的趨勢(F=9.997，10.055，11.415；均P<0.01)，即TRAIL對T-24細胞生長抑制程度呈一定的濃度依賴性；當TRAIL藥物濃度為1 ng/ml時，作用24 h，48 h和72 h后其對T-24細胞的生長抑制程度有一定差異(F=4.244，P<0.05)，其他濃度一定時(3，10，30，100，300，1 000 ng/ml)，作用不同時間后TRAIL對T-24細胞生長抑制程度并無明顯差異(F=0.346，0.668，1.497，0.074，0.766，1.874；均P>0.05)。見表1。不同濃度5-Fu作用24 h后對T-24細胞生長抑制程度最大為1 000 μmol/ml組，其次為600 μmol/ml組；作用48 h 600、800和1 000 μmol/ml組細胞生存率均低于70%；作用72 h 1 000 μmol/ml組細胞生存率最低，其次為800 μmol/ml組，相同作用時間下，隨著藥物濃度不斷上升，5-Fu對T-24細胞生長抑制程度呈現上升趨勢，不同濃度組間存在顯著差異(F=44.130，56.379，124.851；均P<0.01)；當5-Fu濃度為400 μmol/ml時，隨著作用時間不斷延長，其對T-24細胞生長抑制程度無明顯差異(F=1.056，P=0.384)，當濃度為200，600，800和1 000 μmol/ml時，隨著作用時間不斷延長，5-Fu對T-24細胞生長抑制程度呈現出明顯增強趨勢(F=9.200，11.229，12.945，7.756；均P<0.05)，見表2。聯合10 ng/ml TRAIL處理48 h后0、200、400、600、800、1 000 μmol/ml 5-Fu組T-24細胞生長抑制率分別為(3.85±0.88)%、(8.41±0.74)%、(16.39±2.72)%、(26.27±1.72)%、(28.99±3.36)%和(30.18±1.34)%，當5-Fu藥物濃度為0(0)和800 μmol/ml〔(20.77±1.68)%〕時，聯合10 ng/ml TRAIL細胞生長抑制率明顯高于單用同濃度5-Fu組(t=75.324，22.024；均P<0.01)。200、400、600和1 000 μmol/ml 5-Fu單藥處理〔(10.76±1.78)%、(14.17±2.75)%、(28.01±1.66)%、(32.53±3.65)%〕和聯合TRAIL處理對細胞生長抑制程度并沒有明顯差異〔t=5.891，1.310，2.130，1.460；均P<0.05〕。

表1 不同濃度TRAIL對T-24細胞生存率的影響

與同時點其他濃度組比較：1)P<0.01；與同濃度前一時間點比較：2)P<0.05，下表同

表2 不同濃度5-Fu對T-24細胞生存率的影響

2.3TRAIL對T-24細胞凋亡率的影響 10、100、1 000 ng/ml TRAIL處理T-24細胞48 h后細胞凋亡率分別為(3.75±0.31)%、(7.82±1.07)%和(7.78±3.15)%，較0 ng/ml組稍增高但無統計學差異〔(1.41±0.51)%，F=4.399，P=0.067〕。

3 討 論

當腫瘤細胞獲取黏附并穿透脈管的能力后便可以從原發灶經循環系統向其他部位發生轉移擴散，同時循環中的腫瘤細胞不時會受到如自然殺傷細胞等免疫細胞等發出的凋亡誘導信號作用而發生凋亡，二者激烈競爭決定腫瘤細胞的存活〔3〕。長期以來，各種抗腫瘤措施也主要是致力于凋亡誘導因素方面的研究而誕生，但事實上，盡管有眾多凋亡誘導因素存在，腫瘤細胞仍然能夠發生轉移，引起高達90%的致死率，這就使得腫瘤的治療一直成為人類難以克服的難題。TRAIL為TNF超家族的第三個成員，其基因位于3號染色體上，含有4個內含子和5個外顯子，擁有眾多生物學功能。研究表明TRAIL具有強大的抗腫瘤活性，卻對正常組織細胞毒性極地，同時還參與機體的免疫調節、免疫自穩及免疫監視從而在一定程度上增強機體的免疫力，也可以起到一定的抗腫瘤作用〔4〕。本研究顯示單獨應用TRAIL對T-24細胞生長具有一定的抑制作用，但這種抑制作用有限，呈現出一定的濃度依賴性；結合凋亡率分析其誘導T-24細胞凋亡發生的能力有限，同5-Fu聯合應用時在抑制T-24細胞生長方面同單用TRAIL相比并沒有顯著差異，但張少華等〔2〕研究證實TRAIL同順鉑聯合應用時能明顯提高卵巢癌細胞株CAOV3對藥物的敏感性，這就表明TRAIL提高傳統化療藥物敏感性的特點具有一定的細胞選擇性，期待后續的實驗選擇其他膀胱癌細胞株系來探討TRAIL的腫瘤細胞凋亡誘導能力和傳統化療藥物的增敏性能。本實驗證實新型抗腫瘤藥物TRAIL對體外培養人膀胱癌T-24細胞的生長抑制作用和敏化5-Fu對T24細胞治療效果的作用有限，其具體的機制還需要更深入研究予以探索，可能與T-24細胞表面TRAIL受體的表達情況有關〔5〕。但是，TRAIL優先誘導腫瘤細胞發生凋亡而不影響正常細胞的特性使其有望成為經典的腫瘤化療藥物。

1毛健偉，李慶文.肌層浸潤性膀胱癌的治療進展〔J〕.中華全科醫學，2013；11(5)：778-80.

2張少華，楊筱鳳，王 莉，等.TRAIL聯合順鉑對卵巢癌細胞株CAOV3增殖抑制的實驗研究〔J〕.山西醫科大學學報，2014；45(5)：350-2.

3Li J，King MR.Adhesion receptors as therapeutic targets for circulating tumor cells〔J〕.Front Oncol,2012;2:79.

4許 飛，趙華善，魏云巍，等.腫瘤壞死因子相關凋亡誘導配體腫瘤治療研究進展〔J〕.中華臨床醫師雜志(電子版)，2013；7(5)：2157-60.

5田 梅，樸春姬，趙寶峰，等.可溶性人TRAIL基因表達載體的構建及其誘導腫瘤細胞凋亡的實驗研究〔J〕.中國老年學雜志，2006；26(11)：1495-7.

R73-3

A

1005-9202(2017)23-5796-03；

10.3969/j.issn.1005-9202.2017.23.020

1 三峽大學仁和醫院

董自強(1964-)，男，教授，碩士生導師，主要從事泌尿外科常見疾病的診治研究。

肖建華(1987-)，男，碩士，主治醫師，主要從事泌尿外科腫瘤治療研究。

〔2016-07-06修回〕

(編輯 曹夢園)