氯吡格雷抵抗與血小板內皮聚集受體基因多態性的相關性

馮希振 王 雁

(青島大學醫學院，山東 青島 266000)

氯吡格雷抵抗與血小板內皮聚集受體基因多態性的相關性

馮希振 王 雁1

(青島大學醫學院，山東 青島 266000)

目的探討血小板內皮聚集受體(PEAR)1基因單核苷酸多態性與缺血性腦卒中患者氯吡格雷抵抗(CR)的關系。方法納入225例中國漢族缺血性腦卒中患者，服用100 mg阿司匹林及75 mg氯吡格雷雙抗治療7 d后，根據血栓彈力圖(TEG)結果將其分為CR組和氯吡格雷敏感(CS)組。采用聚合酶鏈反應-限制性片段長度多態性(PCR-RFLP)法及直接測序法檢測PEAR1基因的突變情況，利用多因素回歸分析CR與PEAR1基因型及等位基因頻率的關系。結果47例(20.9%)患者發生CR。PEAR1基因分布頻率符合Hardy-Weinberg平衡定律，其中rs41273215位點CC基因型在CR組與CS組分布頻率差異有統計學意義(P=0.021)，攜帶CC基因型比CT+TT基因型更易發生CR(OR=2.525，95%CI：1.300～4.905)，且C等位基因在CR組發生頻率較CS組高1.695倍(OR=1.695，95%CI：1.046～2.746)。未發現rs3737224位點基因多態性與CR的相關性，SHEsis軟件分析兩基因位點間不存在連鎖不平衡(D′=0.28;r2>0.06)，無法構建單倍型。多因素回歸分析后，rs41273215位點CC基因型是CR獨立危險因素(P=0.007，OR=2.802，95%CI：1.321～5.943)。結論PEAR1基因rs41273215位點C等位基因與中國漢族缺血性腦卒中患者CR的發生有關。

血小板內皮聚集受體基因；氯吡格雷抵抗；單核苷酸多態性

對于氯吡格雷抵抗(CR)的患者，調整用藥劑量或更換藥物仍有部分患者發生血小板聚集現象〔1～3〕。影響CR的因素混雜，發病機制不明確，目前已知的可能相關因素有患者的服藥依從性，聯合藥物的應用，年齡，性別，體重指數，糖尿病等〔4〕。血小板內皮聚集受體(PEAR)1在2005年被Nanda等〔5〕鑒定為Ⅰ型膜蛋白在血小板和內皮細胞中高度表達，并且參與血小板聚集，通過促進血小板膜蛋白(GP)Ⅱb/Ⅲa介導的血小板黏附和聚集，促進血栓形成。目前國內外對于PEAR1基因多態性與CR關系報道少見，未發現有關PEAR1基因多態性與中國漢族人群缺血性腦卒中患者CR相關報道；本文擬對此做初步探究。

1 資料和方法

1.1研究對象 前瞻性連續收集2014年9月至2016年9月在青島大學附屬醫院神經內科因缺血性腦卒中住院治療的中國漢族患者225例，詳細記錄患者的臨床資料、實驗室檢查結果和神經影像學資料。入組標準：(1)符合缺血性腦卒中疾病的診斷〔6〕及雙抗治療標準〔7〕；(2)雙抗治療(阿司匹林100 mg，氯吡格雷75 mg)7 d以上。排除標準：(1)近1個月內服用其他抗血小板藥物或抗凝藥；(2)1年內有活動性出血史，或伴有惡性腫瘤、血液病、膠原病；(3)血小板計數<100×109/L或>500×109/L；(4)肝、腎功能嚴重異常或凝血功能異常；(5)近期內接受過較大外科手術；(6)阿司匹林或氯吡格雷過敏者。參與者均知情同意。

1.2分組 研究對象均服用阿司匹林100 mg及氯吡格雷75 mg連續7 d，抽取外周靜脈血，根據血栓彈力圖(TEG)測定二磷酸腺苷(ADP)誘導的血小板聚集率分為敏感組(CS：ADP抑制率≥30%)和抵抗組(CR：ADP抑制率<30%)〔8〕。

1.3基因檢測 所有患者抽取外周靜脈血3 ml，-20℃保存于乙二胺四乙酸(EDTA)管中，按照DNA提取試劑盒(Tiangen)說明書進行規范操作提取DNA，保存于-20℃。采用聚合酶鏈反應-限制性片段長度多態性技術(PCR-RFLP)及直接測序法檢測基因型。PCR反應體系：基因組DNA 2 μl，上下游引物各5 μl、2×Taq Mix 12.5 μl(北京艾德萊生物科技有限公司)加超純水0.5 μl補至25 μl體系。PCR擴增條件：94℃ 3 min；94℃ 30 s、58.5℃和59.5℃各30 s、72℃ 30 s；72℃ 5 min，擴增產物用2%瓊脂糖凝膠電泳，凝膠成像檢測PCR擴增產物，rs41273215正向5′-AGCTTGGAAGCCTTTGGTTGT-3′,反向5′-GGTAAGGGTTAAGTTGGAGGCA-3′,退火溫度58.5℃，循環次數30次，內切酶 AcuⅠ，酶切片段TT：469 bp，CC：260，209 bp，CT：469，260，209 bp；rs3737224正向5′-TTAGCCTTCTGCTCCGCATC-3′，反向5′-GTCCAGCACTCACCGGAC-3′，退火溫度59.5℃，循環次數30次，內切酶MspⅠ，酶切片段TT：351 bp，CC：211，140 bp，CT：351，211，140 bp。取上述PCR產物2 μl，內切酶1 μl，10×NEB緩沖液2 μl，滅菌離子雙蒸水5 μl，反應總體積10 μl。37℃酶切至少1 h終止酶切反應。反應產物用2%瓊脂糖凝膠，Gel red染色，140 V電壓，300 mA電流穩壓電泳40 min，凝膠系統成像，觀察結果并照相。樣本測序及PCR引物由生工生物工程(上海)股份有限公司完成。

1.4統計學方法 應用SPSS19.0軟件進行t、χ2檢驗，單倍型分析用SHEsis軟件在線分析；采用多因素Logistic回歸分析。

2 結 果

2.1兩組間一般資料比較 CR組47例，CS組178例。CR組女性、吸煙史、飲酒史頻率及空腹血糖、高密度脂蛋白數值較CS組低(P<0.05)，但兩組年齡、高血壓、冠心病及低密度脂蛋白水平對比差異無統計學意義(P>0.05)。見表1。

2.2PEAR1的2個單核苷酸多態性(SNP)基因型和等位基因頻率分布 PEAR1基因兩位點的基因型分布均符合Hardy-Weinberg平衡(P>0.05)，具有群體代表性。兩位點的擴增產物分別是469 bp，351 bp，兩種基因位點均為CT多態，存在3種基因型：CC型，CT型，TT型。兩位點的SNP酶切產物電泳圖及測序結果見圖1，圖2。rs41273215位點CC基因型在CR組的分布明顯高于CS組(χ2=7.750,P=0.005)，其C等位基因頻率在CR組較CS組顯示有較高的攜帶頻率(OR=1.722，95%CI：1.046～2.786)；兩組rs41273215的CC和CT+TT基因型比較差異有統計學意義(OR=2.525，95%CI：1.300～4.905)；兩組rs3737224位點的3種基因型分布差異無統計學意義(OR=0.893，95%CI：0.462～1.727)，兩組C等位基因頻率差異無統計學意義(OR=0.783，95%CI：0.490～1.251)，見表2。

2.3多因素回歸分析 rs41273215位點的CC基因型與腦血管病患者CR的發生呈顯著相關(OR=2.802，95%CI：1.321～5.943)。女性及空腹血糖也是CR的獨立危險因素。見表3。

M：Marker;1個條帶為TT型(突變型)純合子;2個條帶為CC型(野生型)純合子；3個條帶為CT型雜合子圖1 rs41273215、rs3737224位點的SNP酶切產物電泳圖

A、B、C箭頭所示分別是rs41273215位點的CC型、CT型、TT型圖2 PEAR1基因測序圖譜

表1 兩組臨床資料比較〔n(%)〕

表2 兩組各位點等位基因頻率及基因型分布特征〔n(%)〕

表3 氯吡格雷抵抗相關危險因素Logistic回歸分析

3 討 論

血小板的作用是正常止血的關鍵，也與血栓形成風險相關。已知PEAR1是最近發現的一種可以影響血小板聚集和內皮功能的血小板轉運蛋白，其在循環的血小板表面低水平表達，在ADP、膠原相關肽(CRP-XL)及其他因素刺激下，PEAR1磷酸化進而表達上調，促進GPⅡb/Ⅲa介導的血小板聚集和黏附〔9〕，血小板膜糖蛋白GPⅢa 與GPⅡb 結合構成纖維蛋白原受體。GPⅡb/Ⅲa 活化并與纖維蛋白原結合是引起血小板聚集的最終共同途徑參與血栓形成〔10〕。

本研究中CR的發生率與前人研究的結果相符〔9～11〕。本研究提示CC基因型可能與CR相關。本研究結果表明rs41273215的C等位基因的攜帶者較T等位基因攜帶者發生CR的概率增加。 Kim等〔11〕對健康中國人的研究發現口服普拉格雷相關的ADP誘導的血小板聚集與PEAR1的兩基因位點rs41273215和rs3737224相關。Joshua等〔12〕調查研究了500例健康的北歐人，同樣發現在其研究的PEAR1的14個基因多態性位點中，rs41273215和rs3737224兩基因位點與血小板聚集有關，但rs3737224位點引起血小板聚集是通過CRP-XL而非ADP誘導，而入組病人均為接受ADP作為誘導劑，這可能是導致該位點與CR結果陰性的原因。

rs3737224基因位點位于基因編碼的第12外顯子區，而rs41273215位點位于基因編碼的第15內含子區，推測該位點在內含子區可能作為增強子的結合位點來上調基因的表達。

目前關于PEAR1基因研究熱點為同樣位于內含子區的 rs12041331位點，其A等位基因攜帶者會顯著增加心肌梗死的風險〔12〕。更新的研究表明，A等位基因顯著影響內皮細胞的遷移，進而影響血栓形成〔13〕。而關于本研究涉及的兩位點與臨床危險事件的發生仍需進一步探究。有文獻指出，采用VerifyNow發現阿司匹林服用會影響氯吡格雷的結果，但氯吡格雷對阿司匹林檢測未見明顯影響，而采用血小板血管擴張劑刺激磷蛋白的磷酸化(VASP-P)檢測發現阿司匹林不會影響ADP誘導的血小板聚集〔14〕。另外，本實驗研究中納入的病例樣本量有限，還需要進一步大樣本多中心檢測。

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R743.32

A

1005-9202(2017)23-5834-03；

10.3969/j.issn.1005-9202.2017.23.039

青島大學附屬醫院課題(15-9-2-92-nsh)

1 青島大學附屬醫院神經內科

王 雁(1968-)，女，主任醫師，主要從事腦血管病、癲癇研究。

馮希振(1990-)，女，住院醫師，主要從事腦血管病研究。

〔2017-06-11修回〕

(編輯 袁左鳴)