G6PC基因在糖尿病患者中的表達及其與糖尿病腎病發生的相關性

宣國紅 單平囡 茹金城 陳建江

(中國醫科大學紹興醫院檢驗科，浙江 紹興 312030)

G6PC基因在糖尿病患者中的表達及其與糖尿病腎病發生的相關性

宣國紅 單平囡 茹金城 陳建江

(中國醫科大學紹興醫院檢驗科，浙江 紹興 312030)

目的探討糖尿病(DM)患者外周血白細胞中葡萄糖-6-磷酸脫氫酶(G6PC)基因的表達變化及其與糖尿病腎病(DN)發生的相關性。方法選取30例DM患者作為實驗組(其中10例DN患者)，20例健康體檢者為對照組，采用RT-PCR法檢測DM患者外周血白細胞G6PC mRNA表達水平(以β-actin為內參)，同時比較DN患者與腎功能正常DM患者之間G6PC mRNA表達差異。結果與對照組比較，DM組患者G6PC的mRNA表達明顯降低(0.65±0.19 vs 1.54±0.32，P<0.05)。DN組G6PC mRNA表達量顯著低于腎功能正常DM組患者(P<0.05)。結論DM患者外周血白細胞G6PC基因表達下降，其可能在DN發生及進展中具有重要作用。

糖尿病;白細胞；葡萄糖-6-磷酸脫氫酶基因

葡萄糖6磷酸酶(G6P)是人體葡糖糖代謝過程中重要的一種酶，也是糖異生和糖原分解過程中的限速酶，其活性及表達量的變化直接影響內生糖的輸出，也直接與糖尿病(DM)的發生有關〔1，2〕。而G6P脫氫酶(G6PC)作為合成G6P的重要亞基，其表達能力的變化直接影響G6P的合成，也直接影響DM的發生。研究表明，可能受到腫瘤壞死因子(TNF)高表達的調控，糖尿病腎病(DN)患者白細胞中代謝酶基因的表達量下降，導致胰島素刺激時細胞攝取葡萄糖能力降低，從而加重胰島素抵抗，最終導致DM及其相關腎病的發生〔3〕。本研究探討G6PC基因表達的變化及其在DM及DN發生發展機制中的作用。

1 材料與方法

1.1臨床資料 收集紹興醫院2013～2014年收治的DN患者30例，均按1999年WHO糖尿病診斷及分型標準斷：空腹血漿葡萄糖≥7.0 mmol/L或隨機血漿葡萄糖≥11.1 mmol/L或餐后2 h血糖≥11.1 mmol/L，符合上述標準之一者，在次日復診仍符合三條標準之一者確診為DM患者，并排除與DM相關的其他內分泌疾病、肝膽疾病等，其中20例為腎功能正常患者，10例為DN患者(24 h尿白蛋白排泄率連續兩次以上>30 mg/24 h)。20例對照組來自同期同年齡段健康體檢人群，均排除DN、腎臟疾病、高脂血癥、高血壓及心腦血管疾病病史，均簽訂知情同意書，并通過醫學倫理委員會同意。

1.2實驗材料 TRIZOL試劑、無RNA酶的水(Invitrogen life technologies)；氯仿、異丙醇、100%乙醇、淋巴細胞分離液(上海化學試劑有限公司)；反轉錄試劑盒 (Invitrogen life technologies)，PCR儀(ABI公司)，高速離心機(貝克曼公司)。

1.3外周血白細胞的分離 將2 ml淋巴細胞分離液加入離心管中，取正常人或患者抗凝血液1 ml，加入等量磷酸鹽緩沖液(PBS)，混勻后小心加入淋巴細胞分離液上層，4 000 r/min離心15 min，離心后分為上層的血清，中間層的白細胞和下層的紅細胞，吸取白細胞，加入2 ml PBS，吹打混勻，2 000 r/min離心5 min，去上清，1×107細胞加入1 ml TRIZOL試劑，反復吹打使細胞完全裂解，-80℃低溫冰箱保存。

1.4RNA的提取及RT-PCR 分離的白細胞采用TRIZOL試劑提取RNA。紫外分光光度計測量RNA純度，立即按照逆轉錄試劑盒進行逆轉錄反應，具體操作步驟參照說明書。G6PC基因序列上游引物5′- CATCGCCTGCGTTATCCTCA -3′,下游引物5′- CTGCAGTAGGTGGTTCTGCATC-3′,擴增片段453 bp；同時以β-actin為內參照物,上游引物5′- TGACGTGGACATCCGCAAAG -3′,下游引物5′-CTGGAAGGTGGACAGCGAGG -3′,擴增片段208 bp。以上引物均由大連寶生物工程公司合成。PCR產物經1.5 %瓊脂糖凝膠電泳并與用凝膠成像儀(北京六一公司)成像及Image-Pro Plus軟件對圖像進行分析(以G6PC基因與β-actin的條帶積分光密度比值表示其mRNA 的表達水平)。

1.5統計學方法 采用SPSS19.0軟件進行t檢驗。

2 結 果

DM組G6PC mRNA表達量(0.65±0.19)顯著低于對照組(1.54±0.32，t=12.261，P=0.000)。DN組G6PC mRNA表達量(0.32±0.109)明顯低于腎功能正常的DM患者(0.74±0.22，t=9.962，P=0.003)。見圖1。

M:Marker;1,4:DN組；2，5：腎功能正常DM組；3，6：對照組圖1 各組G6PC mRNA表達

3 討 論

DM發病機制復雜，臨床主要表現出高血糖的致病特點〔4〕。G6P是調節血糖代謝過程中的關鍵限速酶，它是一種結合膜蛋白系統，是位于內質網系統肝腎糖異生途徑的最后步驟，G6PC的表達量直接影響G6P的表達量，從而影響葡萄糖的代謝，或而導致DM的發生〔5〕。此外，DN是DM患者常見的微血管并發癥，是引起終末期腎臟疾病的主要病因。研究表明，DM患者近50%發生微量蛋白尿，近30%患者終末期會發生DN〔6〕。已有研究證實G6PC表達量降低與DN的發生發展相關〔7〕。DM時長期高血糖狀態所誘發的機體代謝及血流動力學改變致使腎臟組織發生病理改變。主要表現為系膜增生、基底膜增厚、腎小球硬化，進而發展為DN。本研究發現DN患者外周血白細胞G6PC基因的表達量顯著低于正常人DN患者G6PC表達量顯著低于腎功能正常DM患者。這或許因DN患者微血管病變引起，而微血管病變是長期及持續性高血糖作用的結果。DN發生時，腎臟組織以系膜增生為主，而TNF則主要通過抑制G6PC等葡萄糖代謝酶基因轉錄，而導致胰島素刺激細胞攝取葡萄糖能力降低，而促進DM及DN的發生〔8～10〕。

1李俊燕,譚英姿,馮國鄞,等.糖尿病腎病遺傳學研究進展〔J〕.遺傳,2012;34(12):1537-44.

2Resaz R,Vanni C,Segalerba D,etal.Development of hepatocellular adenomas and carcinomas in mice with liver-specific G6Pase-α deficiency〔J〕.Dis Model Mech,2014;7(9):1083-91.

3張 松,朱 琳,郝 軍,等.血清TNF-α升高對糖尿病腎臟脂質積聚的影響研究〔J〕.中國藥理學通報,2014;30(8):1161-5.

4方顯鋒,劉德敏,孫 穎,等.葡萄糖和木糖醇對葡萄糖6磷酸酶基因表達的調節作用〔J〕.天津醫藥,2005;33(1):30-2.

5魏寒松,馬春紅,魏殿軍,等.葡萄糖-6-磷酸酶催化亞基-2基因多態性及其血糖調節的研究進展〔J〕.中國糖尿病雜志,2014;22(7):664-6.

6王興盛.糖尿病腎病與糖尿病腎病合并非糖尿病腎病的病理及臨床特征分析〔J〕.醫學臨床研究,2015;32(1):151-2.

7Abbadi S,Rodarte JJ,Abutaleb A,etal.Glucose-6-phosphatase is a key metabolic regulator of glioblastoma invasion〔J〕.Mol Cancer Res,2014;12(11):1547-59.

8林子桐,張 超,沈雪梅,等.糖尿病腎病發病機制研究進展〔J〕.中國藥理學與毒理學雜志,2014;28(5):765-73.

9Zheng BX,Lin Q,Li M,etal.Three novel mutations of the G6PC gene identified in Chinese patients with glycogen storage disease type Ⅰa〔J〕.Eur J Pediatr,2015;174(1):59-63.

10劉栩晗,李國生,朱 華,等.小檗堿對2型糖尿病中國地鼠肝臟葡萄糖激酶、葡萄糖-6-磷酸酶和磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶mRNA表達的影響〔J〕.中國比較醫學雜志,2008;18(4):9-13.

R587

A

1005-9202(2017)23-5843-02；

10.3969/j.issn.1005-9202.2017.23.043

陳建江(1968-)，男，副主任技師，主要從事糖尿病感染相關研究。

宣國紅(1969-)，女，副主任技師，主要從事糖尿病相關基因研究。

〔2016-09-24修回〕

(編輯 曹夢園)