黑素細胞自噬與老年白癜風患者臨床類型的關系

王華清

(日照市皮膚病防治所，山東 日照 276800)

黑素細胞自噬與老年白癜風患者臨床類型的關系

王華清

(日照市皮膚病防治所，山東 日照 276800)

目的探討黑素細胞自噬和老年白癜風患者臨床類型的關系。方法選取88例老年白癜風患者，包括41例節段型白癜風患者(節段型組)和47例泛發型白癜風患者(泛發型組)，同時選取健康體檢的健康老年志愿者88例為對照組。比較節段型組和泛發型組患者的臨床特征，比較節段型組和泛發型組白斑區周圍正常膚色部位皮膚和對照組任意部位正常膚色皮膚的黑素細胞誘導前后自噬體數量和微管相關蛋白1輕鏈3(LC3)Ⅱ、小眼球畸形相關轉錄因子(MITF)、酪氨酸酶相關蛋白(TRPs)相對表達情況。結果節段型組和泛發型組發病年齡、家族史、伴有暈痣和復發率差異無統計學意義(均P>0.05)；節段型組同形反應少于泛發型組(P<0.05)。誘導前節段型組和對照組可見自噬點數目顯著多于泛發型組(P<0.05)；誘導后3組自噬點數目較誘導前均顯著增多，且泛發型組顯著多于節段型組和對照組，對照組顯著多于節段型組(P<0.05)。誘導前泛發型組MITF顯著高于節段型組和泛發型組，LC3Ⅱ、TYR、TYRP1和TYRP2均顯著低于節段型組和泛發型組；誘導后3組MITF、LC3Ⅱ、TYR、TYRP1較誘導前均顯著升高，且泛發型組MITF、TYR、TYRP1高于節段型組和泛發型組(P<0.05)。結論白癜風患者黑素細胞存在自噬現象，對功能性分子表達產生影響，且泛發型白癜風黑素細胞自噬現象和對功能性分子表達的影響較大。

節段型；泛發型；白癜風；黑素細胞自噬

白癜風根據面積和皮損部位可分為泛發型、節段型和局限型〔1〕。目前白癜風頑固難治，病程長，存在治療抵抗〔2〕。白癜風可發于任何年齡，但臨床上目前對其病因并未明確。已有研究指出〔3〕，自身免疫、遺傳、壓力、神經假說、自身細胞毒素等均可能誘發白癜風，白癜風的病理特點為皮損處黑素消失，毛囊黑素細胞、表皮基底層黑素細胞缺失或喪失生成功能。自噬是細胞內的“自食”現象，通過溶酶體和自噬內涵體的共同作用對細胞內需要降解的細胞器進行降解，在細胞低于外界能量缺乏、饑餓、應激等不良環境時發揮重要作用，但自噬不足或多度均可能導致機體病變。有學者〔4〕認為黑素細胞自噬缺失與白癜風的發病有密切相關性。本研究旨在探討黑素細胞自噬與老年白癜風患者臨床類型的關系。

1 資料與方法

1.1一般資料 選取2014年1月至2017年1月日照市皮膚病防治所收治的88例老年白癜風患者。節段型組41例中男22例，女19例；年齡65～87〔平均(74.27±7.43)〕歲；病程2～36個月，平均(23.11±7.49)個月。泛發型組47例中男26例，女21例，年齡66～88〔平均(73.17±8.26)〕歲，病程2～36個月，平均(22.44±8.43)個月。對照組88例志愿者中男56例，女32例，年齡65～89〔平均(75.28±9.16)〕歲。3組一般資料差異無統計學意義(P>0.05)。具有可比性。納入標準：①經臨床診斷為進展期白癜風；②年齡≥65歲；③治療前3個月內未接受免疫抑制劑、糖皮質激素、紫外線、光敏劑等治療；④自愿參加本項研究并已經簽署知情書。排除標準：①合并橋本甲狀腺炎、斑禿等感染性或自身免疫性疾病者；②合并嚴重的心、肝、腎、肺功能障礙者；③中途退出研究者。

1.2方法

1.2.1培養黑素細胞 將分離的表皮片放入無菌D-Hank液中漂洗2次，37℃下以0.02%乙二胺四乙酸(EDTA)和0.25%胰蛋白酶孵育10 min，在10%含血清的F12培養基內加入細胞懸液并吹打5次，1 000 r/min、半徑5.5 cm離心5 min。用黑素細胞Hu16選擇性培養基吹打成細胞懸液，將細胞濃度調整為5×105個/ml接種在37℃下的培養瓶內，置于5%CO2培養箱內培養3 d后加入(Ceneticin)，將成纖維細胞和角質形成細胞除去，每隔1 d更換1次，當黑素細胞融合達到80%時以0.05%胰酶-EDTA消化黑素細胞，離心后置于F12培養基內待測。

1.2.2觀察黑素細胞結構 使用透射電子顯微鏡對對數生長期黑素細胞進行觀察，將細胞密度為1×105個/ml的黑素細胞接種在6孔板上，細胞貼壁后，加入30 nmol/L的雷帕霉素，培養48 h后置于離心管內，固定，染色進行觀察，拍照和記錄。

1.2.3觀察自噬強度 培養對數生長期黑素細胞，將細胞密度調整至1×105個/ml后使用Ad-LC3-GFP-mRFP腺病毒進行2 h感染，更換培養液對其進行36 h培養。加入30 nmol/L的雷帕霉素，培養48 h，使用雙熒光微管相關蛋白1輕鏈3(LC3)細胞自噬腺病毒報告系統和熒光共聚焦顯微鏡對自噬溶酶體和自噬體數量進行觀察和計算，探究細胞中自噬流(Autophagy Flux)強度。

1.2.4免疫印跡檢測 加入30 nmol/L的雷帕霉素，培養48 h后常規提取蛋白進行10%十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳，然后將其轉印到聚偏氟乙烯(PVDF)膜上。將PVDF膜使用含5%脫脂牛奶的Tris鹽酸緩沖液(TBST)封閉，加入兔抗LC3Ⅱ、兔抗小眼球畸形相關轉錄因子(MITF)、兔抗酪氨酸酶相關蛋白(TYR)、兔抗TYRP1、兔抗TYRP2和鼠抗β-actin單克隆體進行孵育，通過免疫反應條帶讀取蛋白相對表達水平。

1.3統計學方法 應用SPSS19.0軟件行t、χ2檢驗、方差分析。

2 結 果

2.1節段型組和泛發型組患者臨床特征比較 節段型組和泛發型組發病年齡、家族史、伴有暈痣和復發率差異無統計學意義(P>0.05)；節段型組同形反應顯著少于泛發型組(P<0.05)。見表1。

2.2誘導前后3組自噬點數目比較 誘導前節段型組〔(8.68±4.33)個〕和對照組〔(10.21±4.33)個〕可見自噬點數目，顯著多于泛發型組〔(1.07±0.57)個〕(P<0.05)；誘導后3組均顯著增多，且泛發型組〔(33.77±9.49)個〕多于節段型組〔(18.13±5.38)個〕和對照組〔(26.89±7.56)個〕，對照組顯著多于節段組(P<0.05)。

2.3誘導前后3組LC3Ⅱ、MITF、TRPs相對表達比較 誘導前泛發型組MITF顯著高于節段型組和泛發型組，LC3Ⅱ、TYR、TYRP1和TYRP2顯著低于節段型組和泛發型組；誘導后3組MITF、LC3Ⅱ、TYR、TYRP1顯著升高，且泛發型組MITF、TYR、TYRP1顯著高于節段型組和泛發型組(P<0.05)。見表2。

表1 節段型組和泛發型組臨床特征比較〔n(%)〕

表2 誘導前后3組MITF、LC3Ⅱ、TRPs相對表達比較

與對照組比較：1)P<0.05；與節段型組比較：2)P<0.05；與誘導前比較：3)P<0.05

3 討 論

目前臨床上對于白癜風的發病機制并未明確，但研究認為白癜風皮損中黑素細胞的喪失可能是導致白斑的主要原因，且細胞免疫反應和自身抗體反應破壞黑素細胞〔5，6〕。黑素生成是需要多種信號通路相互作用的過程，約150種基因與黑素生成過程有關，涉及蛋白激酶A通路、蛋白激酶C通路、MAPK等通路。自噬是細胞內溶酶體和自噬體共同作用對細胞內容物進行降解的過程，研究指出〔7〕自噬相關基因紫外線抵抗相關基因與尋常型白癜風發病有密切關系。

黑素小體是一種溶酶體相關細胞器，對黑素細胞的黑素合成、黑素儲存和黑素轉運均有較重要作用。研究指出〔8〕，自噬對黑素小體的生成過程有關鍵作用。LC3Ⅱ是自噬特異性標志物之一，與自噬過程中調控黑素正常生成和清除異常黑素小體等過程有密切相關性，本研究結果說明泛發型白癜風患者體內黑素細胞自噬較易被誘導。MITF是黑素代謝過程中重要的轉錄因子，在皮膚生成黑素的過程中，對TYR、TYRP1和TYRP2等因子的表達進行調控，并調節黑素細胞的發育、分化等〔9〕。自噬過程通過對黑素小體的降解過程和生成過程進行調節進而控制黑素的生成，此過程中MITF及其轉錄對網絡功能異常進行調節，白癜風黑素細胞的氧化應激反應對微小RNA25過表達產生影響進而減少MITF轉錄，因而MITF與黑素細胞自噬過程有密切相關性〔10〕。本研究結果說明，泛發型白癜風患者體內自噬點數目較少，但經誘導后自噬點數目顯著增多，體現了泛發型白癜風患者對自噬誘導較敏感。同時泛發型白癜風患者同形反應少于節段型白癜風患者，提示在臨床治療中，對于節段型白癜風患者來說，未發生病變的皮膚色素脫失斑出現的可能性較小，應避免因外傷加重病情，避免誘發新發皮損，且不適合進行自體表皮移植手術〔11〕。

1Anbar TS，Hegazy RA,Picardo M，etal.Beyond vitiligo guidelines：combined stratified/personalized approaches for the vitiligo patient〔J〕.Exp Dermatol，2014；23(4)：219-23.

2Karsli N，Akcali C，Ozgoztasi O，etal.Role of oxidative stress in the pathogenesis of vitiligo with special emphasis on the antioxidant action of narrowband ultraviolet B phototherapy〔J〕.J Int Med Res，2014；42(3)：799-805.

3Zeng Q，Yin J，Fan F，etal.Decreased copper and zinc in sera of Chinese vitiligo patients：a meta-analysis〔J〕.J Dermatol，2014；41(3)：245-51.

4楊莉莉，隗 祎，楊 驥，等.白細胞介素-17對人黑素細胞合成黑素功能的影響〔J〕.中國中西醫結合皮膚性病學雜志，2015；14(4)：215-8.

5Singh A，Kanwar A，Parsad D，etal.Randomized controlled study to evaluate the effectiveness of dexamethasone oral minipulse therapy versus oral minocycline in patients with active vitiligo vulgaris〔J〕.Indian J Dermatol Venereol Leprol，2014；80(1)：29-35.

6王冬雪，朱美財，劉成剛，等.白癜風患者血清抗黑素細胞抗體檢測及相關抗原的鑒定〔J〕.中華微生物學和免疫學雜志，2015；35(1)：27-32.

7王 芳，林新瑜，劉 剛，等.白細胞介素-23對人表皮黑素細胞生物活性的影響〔J〕.中國中西醫結合皮膚性病學雜志，2014；13(6)：341-4.

8于 寧，陸家睛，易雪梅，等.TLR3活化對正常人表皮黑素細胞內活性氧簇表達的影響〔J〕.山東醫藥，2015；55(38)：18-20.

9聶慧瓊，王 平.黑素細胞自噬研究進展〔J〕.中國中西醫結合皮膚性病學雜志，2015；14(6)：397-9.

10田 軍，熊祖明，張國輝，等.氧化應激及免疫在白癜風發病中的作用機制進展〔J〕.實用皮膚病學雜志，2015；8(6)：441-5.

11蘇遠婷，金慧玲，張汝芝，等.黑素瘤的自噬靶向治療〔J〕.國際皮膚性病學雜志，2014；40(5)：299-302.

R758.4+1

A

1005-9202(2017)23-5912-03；

10.3969/j.issn.1005-9202.2017.23.076

王華清(1970-)，女，主治醫師，主要從事皮膚疾病研究。

〔2017-10-11修回〕

(編輯 袁左鳴/滕欣航)