固定化酶催化制備乙酸正丁酯及動力學

王洪海，李旭，李春利，劉文靜

（河北工業大學化工節能過程集成與資源利用國家地方聯合工程實驗室，天津 300130）

固定化酶催化制備乙酸正丁酯及動力學

王洪海，李旭，李春利，劉文靜

（河北工業大學化工節能過程集成與資源利用國家地方聯合工程實驗室，天津 300130）

酯交換反應可用南極假絲酵母脂肪酶B(CALB)作催化劑，采用溶膠-凝膠法固定脂肪酶CALB得到的催化劑顆粒可用于乙酸乙酯和正丁醇的酯交換反應。首先探究了固定化酶的穩定性和重復使用性，然后在間歇反應釜內進行反應動力學實驗，考察了轉速、催化劑用量、酯醇比、溫度等因素對反應的影響，確定了適宜的操作條件。在328.15～343.15 K下，將實驗數據擬合得到反應的動力學方程，通過實驗值與計算值的比較，驗證此宏觀動力學方程合理，可用于模擬計算。

催化劑；生物催化；動力學；酶；固定化

引 言

乙酸正丁酯，簡稱乙酸丁酯，是具有果香氣味的液體，是優良的有機溶劑、分析試劑和萃取劑，也應用于香料工業。隨著環境問題日益突出，人們更傾向于用乙酸正丁酯替代甲苯、二甲苯、酮類等溶劑，因而乙酸正丁酯具有很廣闊的應用前景[1-2]。

工業上普遍采用酸性催化劑合成乙酸正丁酯，由醋酸和丁醇直接酯化反應。但這種方法有很多缺點，如副產物多、轉化率低、設備腐蝕問題等[3]。因此人們研究了新型催化劑來替代濃硫酸，如固體酸[4]和雜多酸[5]等酸性催化劑、分子篩和離子交換樹脂等負載型催化劑[6]、離子液體催化劑[7]等。這些催化劑雖然解決了設備腐蝕、副反應少等缺點，但是仍存在反應轉化率不高和環境污染的問題。因此開發一種生產效率高、環境友好型催化劑和生產工藝顯得尤為重要。

生物酶催化劑與化學催化劑相比具有活性大、選擇性高、反應條件溫和、對環境無污染的優點，但是仍存在使用后無法回收、與產物混合造成后續分離困難、活性和穩定性受溫度和pH影響的問題。而酶的固定化解決了以上問題使其可方便用于催化反應。但是，反應最終的轉化率往往會受熱力學和動力學的限制[8-9]。因此，如果將固定化酶催化劑與反應精餾相結合，即通過移除生成物的方法有望達到提高反應的轉化率與分離效率的目的[10-11]。目前，將生物酶催化與反應精餾相結合的研究還處于起步

階段[12-15]。

本文提出通過凝膠-溶膠的方法固定液態南極假絲酵母脂肪酶B（CALB），用于乙酸乙酯-正丁醇體系酯交換反應，重點探究固定化酶催化酯交換反應的較適宜條件，得出動力學方程，為接下來模擬計算和開發耐高溫生物酶催化劑及酶催化反應精餾打下理論基礎。

1 實驗材料和方法

1.1 材料

CALB發酵液（所含蛋白質量分數為6%），購買于諾維信公司。乙醇（EtOH）、乙酸乙酯（EtAC）、正丁醇（BuOH）、乙酸丁酯（BuAC）、甲醇（MeOH）、聚乙二醇（PEG 400）、乙腈、甲基三甲氧基硅烷（MTMS）均購買于天津市大茂化學試劑廠。氟化鈉購買于天津市風船化學試劑科技有限公司。正硅酸甲酯（TMOS）購買于天津希恩思生化科技有限公司。所有化學試劑均為分析純。

1.2 CALB固定化

本文采用溶膠-凝膠包埋法[16-17]固定 CALB液體，在已知文獻的基礎上進行了優化[18]。需要配制交聯劑和溶劑。交聯劑的配制：將質量比為 1：3：3的正硅酸甲酯、甲基三甲氧基硅烷和甲醇混合，然后在冰水浴中攪拌。溶劑的配制：將質量比為1：4：9：15 的聚乙二醇、氟化鈉（1 mol·L-1）、去離子水、CALB液體混合。交聯劑與溶劑的質量比為3：2。將溶劑倒入交聯劑內，為避免反應放熱對酶的損害，在冰水浴中攪拌 3 min，然后移至室溫即得到含有CALB的溶膠。

凝膠顆粒的制備方法：溶膠在室溫下干燥，約20 min即可得到CALB凝膠固體，用研缽將凝膠研磨成直徑為1～1.5 mm小顆粒，可作為酯交換反應催化劑進行反應動力學探究。

1.3 動力學實驗

選用乙酸乙酯和正丁醇為反應物，反應生成乙酸丁酯和乙醇。為得到在CALB催化作用下的酯交換反應動力學參數，在間歇攪拌釜中進行了此反應動力學實驗。實驗采用水浴加熱，冷卻水冷凝。實驗操作過程如下：首先將所需量的反應物乙酸乙酯和正丁醇分別水浴加熱到指定溫度，然后將二者加入間歇攪拌釜中混合，再加入所需質量的固定化CALB顆粒，密封。打開攪拌器開始反應，每隔30 min進行取樣分析。當分析結果顯示間歇攪拌釜內各組分濃度趨于穩定時，停止反應。

1.4 分析方法

1.4.1 氣相色譜 實驗所需分析的樣品都經氣相色譜進行分析。色譜條件：毛細柱OV1701，50 m×0.32 mm×0.5 μm，氫火焰FID檢測器，柱溫140℃，進樣溫度200℃，檢測室溫度210℃，進樣量為0.2 μl。色譜工作站為N2000，數據處理采用校正歸一法，相對校正因子見表1。

表1 相對校正因子Table 1 Data of correction factor

1.4.2 酶活力測定 用乙酸乙酯和正丁醇的轉酯反應作為酶活性測試方法。實驗條件為乙酸乙酯和正丁醇摩爾比為 1：1，反應溫度為 60℃，轉速為 300 r·min-1。反應后所測樣品和乙腈混合后在離心機離心1.5 min，然后用氣相色譜進行分析。定義每分鐘催化消耗 1 μmol乙酸乙酯所需的酶質量為一個活力單位（U）。固定化脂肪酶活性所占同等質量的游離脂肪酶活性的比例作為固定化脂肪酶的相對活性，并定義相同質量的游離脂肪酶活性為100%[19]。

2 實驗結果與討論

2.1 固定化CALB特性

經上述方法測試得游離酶 CALB的活性為(510±17)U·g-1，固定化凝膠顆粒 CALB 的酶活性為(484±12) U·g-1，此結果表明用溶膠-凝膠法固定后酶活性并沒有明顯損失。

2.1.1 固定化CALB的穩定性 為了確定固定化酶的長期穩定性，將固定化酶放置于25℃的干燥環境中，每間隔5 d對其進行酶活性的測試，其相對活性隨時間的變化如圖1所示。從圖中可以看出，固定化酶的活性并未出現明顯的損失，40 d后其相對活性仍為92%，說明此固定化方法優良。

圖1 固定化酶CALB的穩定性Fig.1 Long-term stability of CALB immobilized

2.1.2 固定化CALB的重復使用性 為了確定固定化酶CALB的重復使用性，采用分批式反應的方法，方法和條件同1.4.2節，反應體系溫度定為70℃，當底物轉化率達到50%時停止反應，用磷酸緩沖液洗滌固定化酶3次并干燥后加入到預熱好的下一批次的反應液中進行反應，每次固定化酶的相對活性隨反應次數的實驗結果如圖2所示。從圖中可以看出，70℃下固定化酶CALB活性略有下降，但仍能在重復使用10次之后保持90%的相對活性，且活性降低趨于平穩，說明重復使用性很好。

2.2 反應動力學研究

2.2.1 外擴散影響的消除 反應動力學數據的測定需要在消除外擴散影響的前提下進行，實驗可以通過增大攪拌速率來消除外擴散的影響。當攪拌速率增大，而正丁醇的最大轉化率不再變化時，即認為消除了外擴散影響。在溫度為 65℃、醇酯摩爾比1：1、催化劑質量為正丁醇質量 5%的條件下，測定正丁醇轉化率隨攪拌速率的影響，結果如圖3所示。從圖中可以看出，當轉速由200 r·min-1增大到300 r·min-1時，正丁醇的轉化率有明顯提高；當攪拌速率繼續增大至400 r·min-1，正丁醇的轉化率變化不大。考慮到過大的攪拌速率不僅會增加能耗，而且也會增大對設備及催化劑顆粒的磨損，因此攪拌速率選擇 300 r·min-1。

圖2 固定化酶CALB的重復使用性Fig.2 Relative activity of CALB after repeated use

圖3 攪拌速率對正丁醇轉化率的影響Fig.3 Effect of stirring rate on conversion of n-butanol

2.2.2 催化劑用量的影響 催化劑的用量對反應影響較大，用量過少會使反應速率減小，導致反應時間增長，催化劑過量又會造成資源的浪費。為了探究合適的催化劑用量對反應的影響，進行了如下實驗：溫度為65℃、醇酯摩爾比1：1，攪拌速率為300 r·min-1，催化劑用量分別為正丁醇質量的5%、10%、15%。對實驗結果分析作圖，見圖 4。可以看出，當催化劑用量由 5%增至 10%時，反應達到平衡的時間明顯縮短；繼續增加催化劑用量至15%時，反應速率并未有明顯提升。因此催化劑用量選定為正丁醇質量的10%。

2.2.3 酯醇摩爾比的影響 反應物的用量對酯交換轉化率起到決定性影響。為探究兩種反應物的進料配比進行了以下實驗。

（1）正丁醇過量

在溫度為65℃，催化劑用量為乙酸乙酯質量的10%，攪拌速率為300 r·min-1的情況下，正丁醇與乙酸乙酯的摩爾比分別為 1：1、1.25：1、1.5：1 時進行了3組平行實驗。催化劑用量對乙酸乙酯的轉化率影響如圖5所示。從圖中可以看出當正丁醇過量后，乙酸乙酯的轉化率未上升反而出現下降，表明增加正丁醇用量對固定化CALB的催化效果有抑制作用[20]。

圖4 催化劑用量對正丁醇轉化率的影響Fig.4 Effect of catalyst dosage on conversion of n-butanol

圖5 進料醇酯比對乙酸乙酯轉化率的影響Fig.5 Effect of initial molar ratio on conversion of ethyl acetate

圖6 進料酯醇比對正丁醇轉化率的影響Fig.6 Effect of initial molar ratio on conversion of n-butanol

圖7 溫度對正丁醇轉化率的影響Fig.7 Effect of temperature on conversion of n-butanol

（2）乙酸乙酯過量

在溫度為 65℃、催化劑用量為正丁醇質量的10%，攪拌速率為300 r·min-1的情況下，乙酸乙酯與正丁醇摩爾比分別為 1：1、1.5：1、2：1、2.5：1 時進行了3組平行實驗，催化劑用量對正丁醇的轉化率影響如圖6所示。從圖中可以看出隨著乙酸乙酯量的增加，正丁醇的轉化率也隨之增加，當酯醇摩爾比為2：1時，再增大乙酸乙酯的量正丁醇轉化率變化不明顯，因此選擇酯醇摩爾比為2：1。

2.2.4 溫度的影響 溫度是影響化學反應平衡的一個重要因素，升高溫度有利于加快反應速率，但是CALB長時間在高溫條件下活性容易受損。為探究酯交換反應的最適溫度，在催化劑用量為正丁醇質量的10%、攪拌速率為300 r·min-1、酯醇摩爾比為2：1的條件下，反應溫度分別為55、60、65、70℃時探究溫度對正丁醇轉化率的影響，實驗結果如圖7所示。從圖7中可以看出，隨著反應溫度升高，正丁醇轉化率也升高。當溫度為70℃時，轉化率最大為61%。實驗中當溫度繼續上升嚴重損傷酶的活性，因此溫度上限選擇70℃。

在328.15、333.15、338.15、343.15 K下得到反應平衡時各物質的平衡摩爾組成，可根據式(1)得到各個溫度下的反應平衡常數

根據平衡常數與反應溫度的關系可得到圖 8，由圖8可得到二者之間的關系為

圖中的點根據Van’t Hoff方程計算反應焓變，可得標準反應焓變為ΔH=11.39 kJ·mol-1，證明反應為吸熱反應，同時根據圖8的變化趨勢也證實了該反應為吸熱反應。

2.2.5 與傳統催化劑的比較 催化劑作為影響反應的重要因素，常用的酯交換反應催化劑有陽離子樹脂、分子篩、無機催化劑等，文獻中對不同種類催化劑的性能進行了深入研究，結果顯示無機催化劑Si-3的催化性能最佳[1]。進行了傳統催化劑Si-3與固定化CALB的催化性能的實驗研究。在Si-3與固定化酶各自最優條件下進行反應，Si-3催化正丁醇能達到的最高轉化率為50%，本文固定化酶催化正丁醇的轉化率能達到60%。表明固定化CALB催化酯交換反應有良好的性能。

圖8 反應溫度對平衡常數的影響Fig.8 Effect of reaction temperature on equilibrium constant

2.3 動力學方程的擬合

該酯交換反應為可逆二級反應[21]，反應速率可描述為

根據動力學模型，將實驗數據進行線性回歸擬合，得到反應的Arrhenius點，見圖9。

由此可得到該酯交換反應的Arrhenius方程為

根據 Arrhenius方程線性回歸擬合可以得到相應的動力學參數，數值見表2。

圖9 反應速率常數與溫度的關系Fig.9 Relation of reaction rate constant and temperature

表2 擬均相模型的動力學參數Table 2 Kinetic parameters

最終得到乙酸乙酯和正丁醇反應的動力學方程

其中

3 結 論

（1）固定化酶CALB的活性與穩定性好，25℃下將固定化酶CALB保存40 d后活性無明顯損失，說明此固定化方法合適。

（2）根據動力學實驗得出乙酸乙酯和正丁醇酯交換反應的最適條件：轉速300 r·min-1、催化劑用量為正丁醇質量的10%、反應溫度70℃、酯醇摩爾比為2：1，且正丁醇過量會抑制CALB的催化活性。

（3）對測得的動力學數據進行擬合，得到乙酸乙酯和正丁醇酯交換反應的動力學方程。

符 號 說 明

A——指前因子，L·mol-1·min-1

c——濃度，mol·L-1

Ea——活化能，J·mol-1

K——反應平衡常數

k——反應速率常數，L·mol·min-1

R——氣體常數，J·mol-1·K-1

r——反應速率，mol·L-1·min-1

T——反應溫度，K

下角標

+——正反應方向

-——逆反應方向

[1]李柏春,耿春霞,張文林,等.酯交換法制備乙酸正丁酯動力學研究[J].化學工程,2016,44(4)：59-63.LI B C,GENG C X,ZHANG W L,et al.Kinetics ofn-butyl acetate prepared by trans-esterification[J].Chemical Engineering,2016,44(4)：59-63.

[2]STEINIGEWEG S,GMEHLING J.n-Butyl acetate synthesisviareactive distillation：thermodynamic aspects,reaction kinetics,pilot-plant experiments,and simulation studies[J].Industrial &Engineering Chemistry Research,2002,41(22)：5483-5490.

[3]SUWANNAKARN K,EDGAR LOTERO A,JR J G G.Solid Br?nsted acid catalysis in the gas-phase esterification of acetic acid[J].Ind.Eng.Che.Res.,2007,46(46)：7050-7056.

[4]HU X,ZHOU Z,SUN D,et al.Esterification of fatty acid by zirconic catalysts[J].Catalysis Letters,2009,133(90)：90-96.

[5]韓越,陳曦,王俊,等.雜多酸 H3PW6Mo6O40超聲催化合成乙酸正丁酯[J].精細化工中間體,2010,27(4)：382-386.HAN Y,CHEN X,WANG J,et al.Synthesis ofn-butyl acetate catalyzed by heteropolyacids H3PW6Mo6O40under ultrasound irradiation[J].Fine Chemical Intermediates,2010,27(4)：382-386.

[6]TIAN Z,DENG Q,YIN Y L,et al.Preparation of SBA-15 molecular sieve modified with lanthanum-and its catalytic activity in synthesis ofn-butyl acetate[J].Petrochem.Tech.,2008,37(7)：667-671.

[7]林文俊,鐘麗娜,陳艷秋,等.季銨鹽型離子液體催化合成乙酸正丁酯[J].化工學報,2011,62(S2)：74-79.LIN W J,ZHONG L N,CHEN Y Q,et al.Quaternary ammonium acidic ionic liquids as esterification catalyst for synthesis ofn-butyl acetate[J].CIESC Journal,2011,62(S2)：74-79.

[8]GORAK A,STANKIEWICZ A.Intensified reaction and separation systems[J].Annual Review of Chemical & Biomolecular Engineering,2011,2(1)：431.

[9]HARMSEN G J.Reactive distillation：the front-runner of industrial process intensification：a full review of commercial applications,research,scale-up,design and operation[J].Chem.Eng.Pro.,2007,46(9)：774-780.

[10]陳夢琪,于娜,劉育良,等.反應精餾隔壁塔生產乙酸正丁酯的優化與控制[J].化工學報,2016,67(12)：5066-5081.CHEN M Q,YU N,LIU Y L,et al.Optimization and control of reactive dividing wall column for production ofn-butyl acetate[J].CIESC Journal,2016,67(12)：5066-5081.

[11]李柏春,韓雪萍,張文林,等.反應精餾制備丁酸酐的過程模擬和實驗研究[J].化學工程,2017,(5)：72-78.LI B C,HAN X P,ZHANG W L,et al.Simulation and experimental research on butyric anhydride synthesis by reactive distillation [J].Chemical Engineering,2017,(5)：72-78.

[12]BECHTOLD M,PANKE S.In situproduct recovery integrated with biotransformations[J].PLOS Computational Biology,2009,1(2)：101-105.

[13]WIERSCHEM M,BOLL S,LUTZE P,et al.Evaluation of the enzymatic reactive distillation for the production of chiral compounds[J].Chemie Ingenieur Technik-CIT,2016,88(1/2)：147-157.

[14]HEILS R,JENSEN J H,WICHERT S,et al.Enzymatic reactive distillation：kinetic resolution of rac-2-pentanol with biocatalytic coatings on structured packings[J].Industrial & Engineering Chemistry Research,2015,54(38)：9458-9467.

[15]KüHN S,SLUYTER G,CHRISTLIEB M A,et al.In situseparation of chiral target compound (S)-2-pentanol in biocatalytic reactive distillation[J].Industrial & Engineering Chemistry Research,2017,56(22)：6451-6461.

[16]REETZ M T,ZONTA A,SIMPELKAMP J.Efficient immobilization of lipases by entrapment in hydrophobic sol-gel materials[J].Biotechnology & Bioengineering,1996,49(5)：527.

[17]REETZ M T,ZONTA A,SIMPELKAMP J.Characterization of hydrophobic sol-gel materials containing entrapped lipases[J].Journal of Sol-Gel Science and Technology,1996,7(1/2)：35-43.

[18]王洪海,李旭,姜艷軍,等.一種反應精餾用酶催化填料及其涂步方法和應用：201710288197.7[P].2017.WANG H H,LI X,JIANG Y J,et al.An enzyme coating method and application of reactive distillation packing：201710288197.7[P].2017.

[19]蔡宏舉,王滿意,周鑫,等.大孔載體制備及其固定化脂肪酶[J].化工學報,2007,58(6)：1529-1534.CAI H J,WANG M Y,ZHOU X,et al.Preparation of macroporous carrier for immobilization of lipase[J].Journal of Chemical Industry and Engineering(China),2007,58(6)：1529-1534.

[20]STROMPEN S,WEISS M,INGRAM T,et al.Kinetic investigation of a solvent-free,chemoenzymatic reaction sequence towards enantioselective synthesis of a β-amino acid ester[J].Biotechnology& Bioengineering,2012,109(6)：1479-1489.

[21]WANG H X,WU C M,BU X W,et al.A benign preparation of sec-butanolviatransesterification from sec-butyl acetate using the acidic imidazolium ionic liquids as catalysts[J].Chem.Eng.Journal,2014,246(12)：366-372.

date:2017-07-10.

Prof.LI Chunli,lichunli_hebut@126.com

supported by the Science and Technology Research and Development Plan of Hebei Province,China (16214505D).

Kinetics ofn-butyl acetate prepared by immobilized enzyme

WANG Honghai,LI Xu,LI Chunli,LIU Wenjing
(National-Local Joint Engineering Laboratory for Energy Conservation of Chemical Process Integration and Resources Utilization,Hebei University of Technology,Tianjin300130,China)

Candida antarcticalipase B(CALB) is immobilized by entrapment in a hydrophobic silica xerogel.Firstly,the stability and reuse of immobilized enzymes are investigated and can be stored for at least 40 d at 25℃without any significant loss of enzyme activity.Then,the transesterification of ethyl acetate withn-butanol in the presence of immobilized CALB is considered in a batch stirred tank reactor.The reaction kinetics is experimentally determined for different stirring rate,catalyst dosage,concentration and temperature.The suitable operating conditions are determined and a pseudo homogeneous kinetic model is established.The calculation data are in better agreement with the experimental data which shows that the kinetic equations are reasonable and suitable for simulation calculation.

catalyst; biocatalysis; kinetics; enzyme; immobilization

TQ 031.2; Q 503

A

0438—1157（2017）12—4685—06

10.11949/j.issn.0438-1157.20170881

2017-07-10收到初稿，2017-09-26收到修改稿。

聯系人：李春利。

王洪海（1974—），男，教授。

河北省科技計劃項目(16214505D)。