膠原蛋白的重組微生物發酵生產研究

冷迎慧

（青海大學生態環境工程學院青海西寧810016）

膠原蛋白的重組微生物發酵生產研究

冷迎慧

（青海大學生態環境工程學院青海西寧810016）

膠原蛋白是一種所有的細胞生物都含有和動物體內含量最豐富的蛋白質，應用十分廣泛，近幾年，人們試圖用重組發酵技術生產膠原蛋白，本篇文章對膠原蛋白的結構、功能以及重組微生物發酵工藝等進行了綜述。

膠原蛋白；發酵；微生物

膠原蛋白被認為是動物體內含量最高的一類蛋白質，幾乎所有的細胞生物都含有膠原蛋白。膠原蛋白廣泛存在于皮膚、肌肉、骨骼中，應用廣泛。例如可以添加入化妝品、飼料中，可以用于整容手術、臨床止血，還可以作為醫學生物材料、組織支架材料等。目前膠原蛋白的需求量逐年增加，但是膠原蛋白的提取方法限制了它的大批量生產，采用基因工程的手段，使用發酵工程表達目的基因產物成為解決這一問題的有效措施。

1 膠原蛋白的結構功能及生產

1.1 膠原蛋白的結構。膠原蛋白結構為三股相互纏繞的多肽鏈組成的長且穩定的三螺旋結構。根據膠原蛋白的三條氨基酸鏈組合的方式不同，膠原蛋白被分為I、II、III等多種類型，目前已經發現28種[1～3]。蛋白質結構由于其初級結構的組合方式不同導致其呈現不同的形態，進而表現出一些功能不同的生物學性質。早在1951年，美國的Paining便已經闡述了膠原蛋白的結構。麻省理工學院的Buehler在2006年再一次在納米水平上詳解了膠原蛋白的結構[4，5]。據研究，膠原蛋白具有一定的生物活性且不溶于水，因此一般情況下不能被蛋白酶利用，而在酸、堿、高溫的條件下，會因為降解而發生性質的改變[6]，明膠可以為蛋白酶所利用。

1.2 膠原蛋白的功能。膠原蛋白對哺乳動物來說十分重要且含量多，具有很多生理調節功能。主要包括：①免疫作用。調節人體的免疫力、抗氧化等。②保健作用。降血壓、防止貧血等。③美容作用。減肥、促進皮膚代謝等。④助吸收。保護胃黏膜、協助母乳分泌等。⑤其他作用。預防和治療骨質疏松癥、緩解關節疼痛等。有些研究顯示，缺少膠原蛋白或蛋白分子缺失會導致人機體性能的改變，導致很多疾病的發生，比如血管基質的動脈粥狀硬化、結締組織遺傳性疾病、血管和腎膠原性基底膜的糖尿病、軟骨發育不良、奧爾波特綜合癥、角膜和晶狀體異常等。

1.3 膠原蛋白的生產。膠原蛋白的生產一般是直接提取、純化自動物組織中，大體過程是先去除油脂，再去除雜蛋白，經過析出、純化等得到膠原蛋白。在很多情況下，單一的提取方法往往得不到預期的效果。提取的方法有：①熱水提取法。熱水提取法是從動物組織中提取膠原蛋白的最常用的一種方法。②酸、堿、中性鹽提取法。酸、堿、中性鹽提取法是指原料在酸性、堿性或中性鹽環境中破壞其分子間的鍵和作用力，引起膠原纖維溶解的一種膠原蛋白提取方法。③酶提取法。酶提取法是采用不同的蛋白酶在一定的外界環境條件下對膠原蛋白進行降解，從而將末端肽切割下來，最終把膠原蛋白提取出來的一種方法。

用傳統的提取方法提純出的膠原蛋白存在動物源疾病的風險，制約了膠原蛋白的開發。且傳統的提取方法所得到的數量有限，雖然已經有美國和日本依賴全化學合成的手段合成出類膠原蛋白，但因化學合成蛋白質技術復雜、產量少、代價昂貴和難于標準化，目前還不能應用于工業化的生產中，因此，利用基因工程方法生產重組的膠原蛋白就越來越成為現在研究發展的趨勢。

2 膠原蛋白在重組系統中的表達

目前許多重組表達系統被應用于人膠原蛋白的重組表達，例如大腸桿菌、酵母、動物細胞、轉基因植物和轉基因動物等，重組人膠原蛋白的表達情況見表2[7]。

表1 人膠原蛋白在各表達系統中的表達總結

2.1 大腸桿菌系統表達膠原蛋白。應用最廣泛的是大腸桿菌表達系統。大腸桿菌表達系統在培養操作上較為簡單，菌種生長迅速，表達量較高且生產成本低廉，發酵周期較短，可規模化發酵培養，抗污染能力也強，且該系統包含多種宿主菌和載體，可以適應不同的表達過程。但是，由于大腸桿菌表達屬于原核生物，在表達真核蛋白過程中目的蛋白常在胞內形成不溶性的包涵體，不具有生物活性。另外，大腸桿菌表達系統還具有原核表達系統的翻譯后的加工修飾體系不完善、產生的致熱原使膠原蛋白難以應用于臨床等，也使得表達產物的生物活性較低。

2.2 酵母表達系統表達膠原蛋白。鑒于大腸桿菌表達系統的種種缺點，于是引入真核表達系統——酵母表達系統，它能保證膠原蛋白經過工程菌足夠的翻譯后修飾，包括糖基化、羥基化等。分泌生產的膠原蛋白具有更好的性能，此研究在國內外也已經取得了許多突破性的成果。構建酵母表達系統首先要選擇合適的宿主菌。較為常用的酵母表達類型有以下幾種：①釀酒酵母。雖然釀酒酵母是最早使用的性狀優良的酵母表達系統，但是它存在著質粒不穩定、表達蛋白產量低等缺點。②乳酸克魯維婭酵母。乳酸克魯維婭酵母最大的特點就是它是一種安全的微生物表達宿主，可以用來大規模工業生產蛋白。③甲醇營養型酵母。甲醇營養型酵母生長所需的碳源及能源是甲醇，迄今為止應用最為廣泛。甲醇營養型酵母中，畢赤酵母表達系統是運用重組生產膠原蛋白的最多的一種。④解脂耶氏酵母。解脂耶氏酵母擁有大量分泌表達蛋白的能力，并且它分泌的蛋白糖基化程度低。⑤栗酒裂殖酵母。栗酒裂殖酵母表達系統最大的優點就是其表達產物形式更貼近于其天然的形式，適用于工業大規模生產應用。

2.3 動植物細胞表達膠原蛋白。利用哺乳動物和昆蟲細胞來生產膠原蛋白，被認為是最早采用重組發酵的一種方式。然而，在哺乳動物細胞中的表達水平極低，不足以應用于商業化的生產中。除此之外，細胞發酵培養的生產成本會比大腸桿菌或者酵母表達系統的成本高5～10倍[8]。近十幾年的研究，有1998年Nokelainen等構建兩株桿狀病毒表達系統，共感染昆蟲細胞后，成功表達具有穩定三螺旋結構的人膠原蛋白，表達量達到50mg/L。2009年，Eskelin等以大麥種子作為宿主成功表達人源I型膠原的全長α-1鏈和45-kDa片段，其中45-kDa片段的產量達到150g/hm2，該產量已具有商業應用前景。

3 發酵條件及工藝研究

3.1 重組大腸桿菌發酵研究

3.1.1 重組大腸桿菌發酵的培養方式。可供重組大腸桿菌高密度發酵培養方式的主要有分批發酵、補料分批發酵、連續分批發酵及透析發酵等。這些發酵方式一般情況下會相互結合使用。①分批發酵，是一種相對封閉的發酵方式，只有氣體流通，發酵液不流通。在發酵過程中，微生物生長符合細菌生長曲線。②補料—分批發酵，被認為是高密度發酵中效果最好的方法，是在分批發酵過程中添加新鮮料液，發酵過程中發酵液的體積在增加的一種方法。③連續發酵，在發酵過程中發酵液新進舊出，原來的體積保持不變。④透析培養，指的是通過半透膜濾去有害代謝產物，并向培養液中添加新的營養物質的培養方式。

3.1.2 影響重組大腸桿菌高密度發酵的因素。①培養基成分。朱才慶等研究的實驗數據表明，在培養大腸桿菌DA19時，在基本培養基中添加混合微量元素更有益于菌體生長。②菌種的質量及接種量。它們會影響菌種在發酵過程中的生長狀況。③培養溫度是影響細菌生長代謝的關鍵。一般大腸桿菌的最適生長溫度和質粒穩定溫度有所不同，故適當地調整培養溫度有利于促進大腸桿菌的生長、提高重組產物的表達量、縮短培養周期[9]。④把pH控制在適宜范圍內。在發酵過程中，大腸桿菌會產生有機酸等代謝產物，使發酵液酸度增加，這對大腸桿菌生長代謝和表達產物不利，因此必須及時調節pH。⑤溶解氧濃度也是一個重要的影響因素。發酵罐內溶解氧濃度過低會抑制菌體生長，過高則會發生Crebtree效應。

3.2 重組酵母發酵研究。研究最多的是針對于畢赤酵母的高密度發酵。畢赤酵母高密度發酵分為兩個階段。第一階段為分批發酵階段，甘油為碳源，直到菌體生長到一定程度。第二階段是當生長到一定程度的菌體“饑餓”約半小時后開始的，此階段屬于補料—分批發酵階段，所補的料為甲醇。培養基的組成及各成分的含量直接影響高密度發酵的效果。①對于一些容易被蛋白酶降解的分泌型蛋白，為減少目的蛋白的降解，一般就要使用含有蛋白陳或者酵母粉的培養基。②培養基中營養物質的含量也需要保持在適當的范圍內，基質濃度過低菌體得不到充足營養，而達不到高密度發酵的效果，基質濃度過高則有可能抑制目的產物的表達而導致生產效率下降。③優化培養基中的組分及其配比可以滿足細胞生長對基質的消耗。劉彥麗等的研究發現PTM1和0.05%的油酸(作消泡劑)能顯著提高外源蛋白的表達。④畢赤酵母雖然在pH值一定范圍內均可生長，但控制pH值為5.0時菌體生長水平和表達外源蛋白水平都達到最高，pH值超過7時菌體量及表達量均不理想。一般BMM培養基自然狀態下的初始pH值為5.5，當pH值在5.0左右改變1個單位或以上，發酵第二階段目的蛋白的表達量就會受到很大的影響。對pH值的調控主要是通過補加氨水或者鹽酸。⑤發酵培養基中溶氧量對好氧菌生長來說也是非常重要的，在發酵過程中可以提供充足的氧氣供應，滿足生產菌對氧的需求，這也是提高菌體發酵表達量的重要因素之一。⑥溫度通過影響酶的活性從而影響發酵。研究表明，當溫度超過32℃，畢赤酵母表達膠原蛋白將受到嚴重影響。

4 發展前景

為了能充分利用膠原蛋白的作用，使膠原蛋白的應用更加廣泛，利用現代生物技術重組發酵生產制備膠原蛋白已成為目前的主流。現在來看，雖然微生物發酵生產膠原蛋白取得了一些進展，但還是存在很多問題。且對于產業化而言，優化發酵工藝是一個永恒的話題。相信隨著技術的發展，膠原蛋白的生產也會逐步優化。

[1]Sato K，Yomogida K，Wada T，et al.Type XXVI collagen,a new member of the collagen family，is specifically expressed in the testis and ovary[J].Journal of Biological Chemistry，2002，277(40)：37678.

[2]MC Gmezguilln，B Gimnez，ME Lpezcaballero，et al.Functional andbioactive properties of collagen and gelatin from alternative sources:A review[J].Food Hydrocolloids，2011，25(8)：1813～1827.

[3]王珊珊.結魚骨膠原膚與活性鈣的制備及其抗骨質疏松活性研究[D].青島：中國海洋大學，2013.

[4]Pauling L，Corey RB.The structure of fibrous proteins of the collagen-gelatin group[J].Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America，1951，37(5)：272～281.

[5]Buehler MJ.Nature designs tough collagen:Explaining the nanostructure of collagenfibrils[J].Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America，2006，103(33)：12285～12290.

[6]王志聰.鰭魚皮膠原蛋白膚對大鼠胃薪膜的保護作用研究[D].青島：中國海洋大學，2013.

[7]唐云平，鄭強，胡斌，等.重組膠原蛋白制備及其應用研究進展[J].食品工業科技，2016(18)：384～387.

[8]Celik E，Calik P.Production of recombinant proteins by yeast cells[J].Biotechnol Adv，2011(2)：19.

[9]尹淑琴，范艷，常亂.基因工程菌的高密度發酵研究[J].安徽農業科學，2007，35(11)：3175～3176，3192.