兔眼藍莓初代培養的建立

郭麗鄭志新武延生

（1邢臺學院化學工程與生物技術學院河北邢臺054001；2河北北方學院園藝系河北張家口075000）

兔眼藍莓初代培養的建立

郭麗1鄭志新2武延生1

（1邢臺學院化學工程與生物技術學院河北邢臺054001；2河北北方學院園藝系河北張家口075000）

以兔眼藍莓栽培品種‘北陸’當年生帶腋芽的莖段為試材，探討其初代培養過程中消毒時間和生長調節劑配比濃度對芽誘導率的影響。試驗結果表明：兔眼藍莓莖段最佳消毒時間是以70%酒精處理30s與0.1%升汞處理8min，以MS+6–BA 0.5mg/L+IBA 0.2mg/L+ZT 2.0mg/L為培養基的芽誘導效果最好，誘導率可達79.0%。

兔眼藍莓；初代培養；消毒時間；生長調節劑

藍莓，學名越橘(Vaccinium vitis–idaea)，屬杜鵑花科(Ericaceae)越橘屬(Vaccinium)，多年生落葉或常綠矮小灌木，原產于北美[1]。目前生產栽培的主要品種分為三大類：高叢藍莓、矮叢藍莓和兔眼藍莓。兔眼藍莓是從野生兔眼越橘類中選育出的栽培品種，由于果實在未成熟前顏色如兔眼一般紅，所以取名為兔眼藍莓[2]。

藍莓果實酸甜可口，具有獨特的營養保健功能，因含有較多的花色苷、黃酮等生理活性物質，具有改善視力、延緩腦神經衰老、防止心血管疾病、提高人體免疫力等功效，是世界糧農組織推薦的五大健康水果之一[3,4]。藍莓的常規繁殖方法速度較慢、繁殖規模受到阻礙且苗木在生長勢、果實品質等諸多方面存在不足。為滿足市場需要，迅速擴大藍莓的生產規模，采用組培法能在較短時間內獲得大量優質苗木。

1 材料與方法

1.1 材料。供試材料為兔眼藍莓栽培品種‘北陸’的當年生帶腋芽的莖段，取自河北北方學院農林科技學院溫室。

1.2 方法

1.2.1 外植體的消毒處理與接種。將采回的外植體用剪刀剪成約2cm長的莖條，去除葉片，保留腋芽，用洗衣粉水浸泡30min后，再用流水沖洗2h，然后在超凈工作臺上進行消毒處理[5]。先用70%酒精浸泡30s，用無菌水沖洗2～3次，再在0.1%升汞中浸泡，設定浸泡時間為4min、6min、8min、10min，無菌水沖洗5次，然后將材料放于無菌濾紙上吸干水分。切去莖條上下兩端的傷口部分，將其剪成0.5～1cm的單芽莖段，接種于培養基上[3]。每個處理接種10瓶，每瓶3～4個外植體，3次重復。所用基本培養基均為MS培養基，添加瓊脂6g/L，蔗糖30g/L，pH值為5.6～5.8。

1.2.2 培養條件。接種的莖段置于25±2℃培養室中培養，光照強度2000lx，每日持續光照16h，14d后統計結果。

2 結果與分析

2.1 不同消毒時間對外植體滅菌效果的影響。在消毒處理中分別用0.1%升汞浸泡4min、6min、8min和10min。接種14d后污染率和死亡率結果見表1。處理A的污染率最高，達到73.3%，由于消毒時間短，導致消毒不夠徹底，還存在大量雜菌，消毒效果不理想；隨著消毒時間逐漸延長，處理B、C、D的污染率分別降至46.7%、26.7%、13.4%，處理B與處理C、D差異顯著，處理C與處理D差異不顯著。同時，隨著消毒時間逐漸延長，死亡率也呈遞增的趨勢，分別為10%、16.7%、23.4%、43.4%，處理D與處理A、B、C存在顯著性差異，說明0.1%升汞是強消毒劑，隨著消毒時間的延長，對外植體細胞的傷害程度也會增大，從而導致外值體死亡；處理C與處理D比較，污染率相差不大，且處理D比處理C的污染率要高，所以處理C最合適。綜上所述，處理C的污染率、褐變與死亡率均在可接受范圍內，在一定程度上既消滅了雜菌又不至于對外植體產生較大毒害，所以用0.1%升汞處理外植體8min較好。

表1 不同滅菌時間對外植體污染率和死亡率比較

2.2 不同生長調節劑配比濃度對芽誘導的影響。將沒有受污染和死亡的兔眼藍莓莖段轉接到誘導培養基上進行誘導培養，所設培養基配方及誘導結果見表2。由表2可知，以6-BA 0.5mg/L+IBA 0.1mg/L+ZT 2.0mg/L的培養基對芽誘導效果最好，達到79.0%。在BA和IBA一定時，隨著ZA的濃度不斷增加，芽誘導率先增加，然后降低。當ZT為2.0mg/L時，芽誘導率最高；當ZT為3.0mg/L時，芽誘導率下降到70.2%?？梢姡蜐舛鹊腪A對芽誘導起到了促進作用，隨著ZA濃度升高，芽誘導效果降低，高濃度ZA對芽誘導具有抑制作用。試驗結果表明，最適宜的兔眼藍莓芽誘導培養基為MS+6-BA 0.5mg/L+IBA 0.1mg/L+ZT 2.0mg/L。

表2 不同生長調節劑配比濃度對芽誘導的影響

3 結論與討論

3.1 結論。采于溫室中的試驗材料，很容易粘附細菌和真菌等。在組織培養中，外植體的消毒效果直接關系到后續芽誘導的效果及組培苗的成活率，確定最佳的消毒方式與時間不可或缺。本試驗通過研究消毒時間的長短，篩選出以兔眼藍莓莖段為外植體的最佳消毒方法為：70%酒精浸泡30s后0.1%升汞浸泡8min。同時，添加一定濃度的生長素和細胞分裂素對于誘導兔眼藍莓的芽具有明顯的促進作用。在兔眼藍莓初代培養的過程中，以MS+6-BA 0.5mg/L+IBA 0.1mg/L+ZT 2.0mg/L為培養基配方的芽誘導效果最佳，誘導率達到79.0%。

3.2 討論。菌類污染是植物組織培養中較為常見的問題，使用的消毒劑既要能夠把外植體表面的雜菌殺死，又必須容易被無菌水從外植體上沖洗干凈而不至于對外植體本身產生較大的毒害作用進而影響其正常生長[5]。0.1%升汞是組織培養中常用的強消毒劑，且較難除去殘留，具有很強的穿透力和殺傷力，容易殺死和損傷細胞，造成外植體的死亡，但其消毒效果也比較明顯。因此在使用時，應當控制好消毒的具體時間，用后要以大量的無菌水多次沖洗，在降低污染率的同時，還要盡可能減少消毒劑對外植體的傷害。所以，篩選準確的消毒時間對后續工作有至關重要的作用。

植物分化是一個復雜的生理生化過程，植物生長調節物質的種類、濃度及組合對不定芽的誘導有極其關鍵的作用。在植物組織培養過程中，愈傷組織的誘導、芽苗的生長受生長素和細胞分裂素的調控。細胞分裂素能誘導不定芽的形成，削弱頂端優勢，促進側芽分化和生長；生長素能促進細胞伸長，誘導愈傷組織產生特別是當二者有效結合時，能更強烈地刺激愈傷組織的形成[6]。本試驗中，單獨添加6-BA與IBA的誘導效果較一般，當添加ZT后，芽誘導率得到有效提高，可見ZT是植物組織培養中的關鍵因素[7]。同時，采用不同的6-BA、IBA與ZT配比濃度，芽誘導的效果也存在差異。試驗表明，當使用6-BA 0.5mg/L+IBA 0.1mg/L+ZT 2.0mg/L的植物生長調節劑配比時，芽誘導率得到顯著提高，達到79.0%。

本試驗對兔眼藍莓的初代培養進行了研究，確定了外植體的最佳消毒方法。通過在MS基本培養基上添加不同濃度的BA、IBA和ZA來比較芽誘導的效果，但其它種類和濃度的生長素和細胞分裂素以及不同種類的基本培養基對于兔眼藍莓初代培養的影響和作用還需要進一步深入的研究。

[1]宋剛，徐銀，宋金耀，等.不同因素對高叢越橘葉片初代培養的影響[J].江蘇農業科學，2010(4)：44～45.

[2]茨韋特科夫·約旦，楊帆，趙燕麗，等.引進國外藍莓品種的組織培養及快繁技術研究[J].黑龍江農業科學，2011(6)：6～8.

[3]孫書偉.藍莓組培苗瓶內生根的探討[J].湖北農業科學，2009，48(4)：786～788.

[4]陳愛美，李凌，曾明.影響兔眼越橘初代培養的因素分析[J].生物技術，2004，14(4)：61.

[5]鄭偉尉，呂錫山，慎家輝，等.兔眼藍莓“園藍”離體培養增殖技術研究[J].中國南方果樹，2013，42(1)：89～91.

[6]鄭春明.植物組織培養技術[M].杭州：浙江大學出版社，2011.

[7]李杰，王明瑩，黃學文，等.不同玉米素濃度對藍莓莖段芽誘導的影響[J].現代農業科技，2013(2)：85～89.