高中生物開放式組織培養實驗設計

楊欣悅

摘 要：實驗目的：考查不同抑菌劑對愈傷組織的形成有何影響，其次尋找接種方式、取材部位等因素對誘導愈傷組織形成的最佳條件，在組織培養過程中，掌握外植體消毒的注意事項，合理選取和控制培養條件。實驗材料：月季花；市售多菌靈和大蒜素。實踐方法：培養基配制，消毒，接種，條件設置。實驗結果：多菌靈在開放式組培中的抑菌效果好，且兩者的成活率都達到或超過了50%。

關鍵詞：開放式組織培養；抑菌劑；效果

中圖分類號：G63 文獻標識碼：A 文章編號：1673-9132（2017）03-0140-02

DOI：10.16657/j.cnki.issn1673-9132.2017.03.090

科學研究表明，植物細胞處于離體狀態時，在一定營養物質、激素和其他外界條件的作用下，表現出全能性，能發育成完整植株。高中生物中通過植物的組織培養實驗來學習植物的無性繁殖，組織培養是把植物的器官、組織以至單個細胞，使其在人工條件下，繼續生長，甚至分化發育成一完整植株的過程，為保證植株成活率，此操作通常在無菌操作環境進行。

在實驗的實施過程中，我們發現植株體幾乎都受到污染發霉，成活率不到10%，究其原因主要有兩個方面：一是班級規模的操作流程不可避免地帶來了很多不確定的污染因素，難以達到植物組織培養對無菌要求極為嚴格的條件；二是在培養的過程中，需要保持恒溫的生長環境以及嚴格的光照時間，對前者尤其有較高的要求。

開放式組織培養是通過在培養基中加入抑菌劑來代替高壓滅菌，避免了絕對的無菌環境，使植物在相對開放的條件下可以良好生長。這種方法能夠降低植物培養繁殖的成本，目前在多種花卉和經濟類作物的工廠化育苗生產實踐中已得到推廣應用。隨著開放式組織培養技術研究的成熟，在高中生物組織培養實驗中應用這一方法，能顯著提高實驗的成功率，改善實驗條件，尤其是邊遠地區學校的實驗環境。

選擇合適的抑菌劑、外植體是開放式組織培養實驗設計的關鍵要素。參考相關文獻資料及中醫理論，我們選取了市售多菌靈和大蒜素作為抑菌劑。大蒜素也可采用自制的方法獲得，文獻[1]提供了相關制作方法及濃度參數。

一、實驗目的和方法

實驗要求能閱讀植物組織培養的相關文獻資料，考查不同抑菌劑對愈傷組織的形成有何影響，其次尋找接種方式、取材部位等因素對誘導愈傷組織形成的最佳條件，在組織培養過程中，掌握外植體消毒的注意事項，合理選取和控制培養條件，對實驗過程中出現的現象及時觀察記錄和分析，加強理論與實踐的聯系，深化對理論知識的理解。根據相關理論和文獻資料，我們設計了以誘導愈傷組織為主的開放式組織培養實驗方案。

（一）外植體材料：月季花

本實驗材料取自盆栽的月季，植物葉片和莖段均是誘導愈傷組織和進行細胞懸浮培養的理想材料，葉片誘導率稍高于莖段，能達到90%以上，莖段培養則最簡便，成苗速度最快，且以莖段中芽為最好，接種后，中段芽第5 天左右就能萌發。為避免誤差和便于得出結果，在選擇外植體時最終確定選用帶腋芽部分的莖段做外植體材料。

（二）主要試劑

MS 基礎培養基、1mg /mL6-BA、0. 5mg /mL NAA、1mol /L NaOH溶液、市售大蒜素、市售多菌靈粉劑。

（三）實驗方法

培養基配制：取2只2000mL規格的錐形瓶，分別標記大蒜素、多菌靈。分別稱量MS 干粉培養基50g 放于錐形瓶中，加800mL 蒸餾水在電熱爐上慢慢攪拌煮沸至溶液完全透明，然后加入蒸餾水將溶液定溶至1000mL。待溶液冷卻至40℃ ～ 50℃ 時，分別在以上2 瓶中分別加入0.15g/mL大蒜素溶液10mL，稀釋600倍的多菌靈溶液，然后加入6-BA 1mg /mL 2mL，NAA 0. 5mg /mL 0. 5mL，混勻后，調節pH 到6. 8，然后將培養基倒入組培瓶中擰緊，每瓶50mL，分別標記所加物質作為記號，水平放置至凝固。

消毒：剪取當年抽生側芽飽滿的幼嫩莖段，剪去頂部和基部并去葉，剪成2cm長帶有側芽的莖段，自來水沖洗10-20分鐘；75%乙醇浸泡30秒，再用0.1%Hgcl2溶液滅菌5-10分鐘，無菌水沖洗4-5次，獲得無菌苗備用。

接種：從瓶中取出月季無菌苗剪取腋芽段插入培養基，以培養基平面不沒過腋芽處為準，擰上蓋子，放入光照培養箱中進行培養。在外植體的接種時采用了垂直接種，斜向上45度接種，采用這樣的接種方式，腋芽再生芽數多，且生長健壯，這與植物的生長習性有一定關系。

培養條件：設置為一般植物組織培養的條件，溫度控制在24℃左右，光照時間為12h/天，光照強度為1000～2000Lx，實驗接種后先暗室培養一周，再在光照下培養。定期觀察記錄，隨時取走出現嚴重污染的組培瓶。

二、結果與分析

經過20天觀察， 兩種培養方式均獲誘導獲得了愈傷組織，統計結果如下表。

通過對這兩種抗菌物質的抗菌效果的比較，得出多菌靈在開放式組培中的抑菌效果較好，且兩者的成活率都達到或超過了50%。這種開放式的方法降低了技術難度，可操作性更強，設備投入成本較低，對于建設植物組織培養實驗有較大的可行性。出芽和生根的再分化實驗過程，可參考相關資料，探究由愈傷組織誘導出芽及生根所需培養基和生長素的最佳濃度配比，調節植物激素的濃度繼續實施。

在開放式組培實驗中，不同的外植體選擇何種抑菌劑及其濃度是非常關鍵的因素，需參考相關文獻及各種生產實踐進一步摸索。多菌靈是一種高效廣譜內吸性殺菌劑，其通過抑制病原菌紡錘體的形成來影響細胞分裂，對多數半知菌和子囊菌具有抑制作用。大蒜提取物中主要成分是大蒜素，具有較強的抗菌消炎作用，對多種球菌、桿菌、真菌、病毒等均有抑制或殺滅作用，其在低濃度時能夠抑制真菌生長，在高濃度時可完全殺死真菌，且大蒜素是生物農藥，對植物生長影響較小，這兩種抑菌劑的應用范圍相對比較廣泛。

以開展開放式組培條件探究實驗為契機，培養學生探究實驗，可以從無菌和抑菌等多種角度對植物組織培養進行探究，在高中學生中開展這方面的課題研究，不僅能鍛煉學生多方面思考創新的能力，并且緊密結合生產實際，是實驗課程改革思路的又一探索模式。

參考文獻：

[1] 王曉煌，黃勝琴，李玲. 4種抑菌劑在煙草開放式組織培養中的應用[J].廣東農業科學，2015， 42（5）：58-62.

[2] 王艷紅，龔束芳，車代弟.豐花月季愈傷組織的誘導及細胞懸浮培養[J].東北農業大學學報，2007，38（2）：161-165.