不同發育時期雞下丘腦和卵巢組織中內參基因表達穩定性分析

袁振杰,陳秋月,姜運良,唐 輝,李顯耀,康 麗*

1.山東農業大學 動物科技學院與動物醫學院,山東 泰安 271018 2.山東農業大學 農學院,山東 泰安 271018

實時熒光定量PCR（Real-time fluorescent quantitative polymerase chain reaction,qRT-PCR）已廣泛應用于基因表達方面的研究。在qRT-PCR應用中，由于不同樣品間RNA的初始量、cDNA合成效率以及PCR反應擴增效率等存在差別，從而影響目標基因表達差異的準確性，因此，需要引入穩定表達的內參基因予以校正[1]。常用的內參基因多為持家基因，如18S核糖體RNA基因（18S rRNA）、beta-肌動蛋白基因（β-actin）和3-磷酸甘油醛脫氫酶基因（GAPDH）等。然而，近年來的研究表明，在不同類型細胞、組織器官、不同實驗處理條件及相同組織的不同發育階段等情況下，持家基因的表達量并非總是恒定的[2]。因此，在特定目標基因表達研究中對候選內參基因的表達穩定性進行評價，篩選出最為穩定的內參基因，是保證研究結果真實可靠的關鍵。

家禽的繁殖性狀受下丘腦-垂體-性腺軸（Hypothalamus-pituitary-gonad,HPG)的調控，目前，對于雞性腺軸上功能基因的表達研究較多，但用于內參的持家基因其組織表達穩定性尚不清楚。因此，本研究利用qRT-PCR方法檢測雞性發育過程中下丘腦和卵巢組織中常用內參基因的表達，并采用geNorm、NormFinder和Bestkeeper軟件對這些基因的表達穩定性進行分析，篩選出用于雞性腺軸上基因表達研究最合適的內參基因。

1 材料和方法

1.1 試驗動物

分別隨機選取30 d、60 d、90 d、100 d、110 d、140 d未開產和140 d開產的濟寧百日雞各4只，頸靜脈放血處死后取下丘腦和卵巢組織，迅速投入液氮并保存。試驗所用雞只遺傳背景相同，采用相同的飼養管理條件，自由采食、自由飲水、自然光照。

1.2 RNA提取和cDNA合成

使用總RNA提取試劑盒（天根，北京）提取不同發育階段雞下丘腦和卵巢組織RNA，用1.2%瓊脂糖凝膠電泳檢測RNA的完整性，并用紫外分光光度計（Eppendorf,Hamburg,Germany）檢測總RNA濃度和純度，A260/280=1.8～2.0，RNA于－80°C保存備用。

cDNA合成采用PrimerScript RT reagent Kit（TaKaRa，大連）反轉錄試劑盒，具體操作按說明書，取1μL總RNA，以Oligo-dT18為引物，完成一鏈cDNA的合成，并于－20°C保存。

1.3 引物設計及合成

根據實時熒光定量PCR引物設計原則，使用DNAMAN 6.0軟件，分別設計GAPDH、β-actin和18S rRNA基因的定量PCR引物（見表1），并由上海生物工程有限公司合成。

表1 實時熒光定量PCR檢測所用候選內參基因的引物信息Table 1 Primer information of candidate reference genes used in qRT-PCR

1.4 實時熒光定量PCR

實時熒光定量PCR（qRT-PCR）反應在Stratagene Mx3000P熒光定量PCR儀上，按照Takara的SYBR premix Ex TaqTMⅡ試劑盒說明書進行，模板、引物濃度及退火溫度等經過摸索獲得最佳反應條件如下：PCR反應體系為15μL包括cDNA模板1.5μL，上下游引物各0.2μL，2×SYBR Premix Ex TaqTM Buffer 7.5μL，RoxII0.3μL，ddH2O 補足至 15μL；PCR 反應程序為 95°C 預變性 5 min；95°C變性30 s，56°C退火30 s，72°C延伸25 s；在延伸階段收集熒光信號強度，共40個循環。熔解曲線分析：95°C 1 min；58°C 30 s，95°C，30 s，58～95°C每個循環全程采集熒光信號1次。每個樣品均設3個重復，儀器自帶軟件自動生成標準曲線和熔解曲線，3個基因的溶解曲線均為單一峰，說明內參基因引物特異性好，無引物二聚體和非特異條帶擴增。獲得3個內參基因標準曲線的相關系數變化范圍為0.996～0.998，根據標準曲線計算的擴增效率為97.3～100.8%。

1.5 數據分析

用2-△Ct（△Ct=各樣本Ct值?最小Ct值）方法計算各基因表達的相對定量數據，用geNorm、NormFinder和BestKeeper軟件對3個內參基因在濟寧百日雞不同發育時期下丘腦和卵巢中的Ct值變化趨勢以及表達穩定性進行統計分析。

2 結果與分析

2.1 內參基因Ct值比較

qRT-PCR中，Ct值的大小反應了基因表達的豐度，Ct值越小，基因表達量越高；反之，Ct值越大，基因表達量越低。在同一組織中每個持家基因所用每個cDNA模板量均相同，比較三個基因的Ct值發現，雞性發育過程中每個內參基因在下丘腦和卵巢組織的表達水平均有一定的變化。如圖1所示，在卵巢中β-actin的Ct值最小（中位數=17.01），表明其表達量最高，18S rRNA和GAPDH兩個基因表達量相對偏低（中位數分別為17.77，17.86），而在下丘腦組織中，18S rRNA的Ct值最小（中位數=16.83），說明其在下丘腦中表達豐度最高，其次是GAPDH（中位數=19.85），β-actin表達量最低（中位數=20.44）。這也表明三個內參基因在雞卵巢和下丘腦組織中的表達量存在差異。

圖1 各內參基因在下丘腦和卵巢組織中Ct值比較Fig.1 The Ct values comparison analysis of every reference gene in hypothalamus and ovary tissue

分別對三個內參基因在30 d、60 d、90 d、100 d、110 d、140 d未開產和140 d開產濟寧百日雞7個不同發育階段下丘腦及卵巢組織中，所有樣本的Ct值變化分析發現，不同基因間Ct值最大值（max）和最小值（min）（見表2，表3）的差值大小（極差）存在差異，這個差值越大，說明該基因在各個樣本間表達的均一程度越差，在下丘腦中各基因極差值由小到大為18S rRNA（1.85）＜GAPDH（2.76）＜β-actin（3.89）；在卵巢中各基因極差值由小到大為18S rRNA（3.79）＜GAPDH（4.29）＜β-actin（4.37），但無論在下丘腦還是卵巢組織，β-actin的Ct值極差均表現為最大。

在基因定量表達分析中，有時需要同時選擇多個內參基因，分析基因間的表達相關性，可為多個內參基因的選擇提供依據。分別對三個內參基因在卵巢及下丘腦組織中表達的相關性進行分析，結果如圖2所示，在下丘腦中，β-actin與GAPDH的相關性也最高（相關系數=0.86），而18S rRNA與GAPDH和β-actin的相關性均較低（相關系數=0.42）。在卵巢中，β-actin與GAPDH的相關性最高（相關系數=0.76），18S rRNA與GAPDH的相關性最低（相關系數=0.25）。

2.2 geNorm軟件分析

通過2–△Ct算法將qRT-PCR得到的Ct值轉換成對應的表達量并輸入geNorm程序，然后計算基因表達穩定度M值，并對內參基因的表達穩定度進行排序，M值越小，基因表達越穩定。結果由圖3可知，三個內參基因的表達穩定性從大到小排序為：下丘腦中GAPDH(0.599)＞β-actin（0.710)＞18S rRNA（0.789）；卵巢中β-actin（1.070)＞GAPDH（1.292）＞18S rRNA（1.395)。說明不同發育時期濟寧百日雞的下丘腦中GAPDH表達穩定性最好，而在卵巢中β-actin的表達最為穩定。

圖3 ge Norm軟件分析內參基因在發育不同階段下丘腦和卵巢組織中表達穩定性M值Fig.3 The expression stability(M values)of reference genes in chicken hypothalamus and ovary tissue by geNorm

2.3 Norm Finder軟件分析

Norm Finder軟件分析內參基因在不同發育階段濟寧百日雞下丘腦、卵巢組織中的表達穩定性，穩定值越小的基因表達最穩定，比較結果見圖4，在下丘腦中3個內參基因的穩定性從大到小為GAPDH（0.161）＞β-actin（0.226）＞18S rRNA（0.265），而卵巢中穩定性從大到小是β-actin（0.342）＞GAPDH（0.517）＞18S rRNA（0.573），說明下丘腦和卵巢中表達穩定性最好的分別是GAPDH和β-actin，這與geNorm的分析結果一致。

圖4 Norm Finder軟件分析內參基因在發育不同階段下丘腦和卵巢組織中的表達穩定值Fig.4 The expression stability values of reference genes in chicken hypothalamus and ovary tissue by Norm Finder

2.4 Bestkeeper軟件分析

Bestkeeper軟件在每個基因中直接產生配對相關系數和Bestkeeper指數，指數的產生是由所有內參基因Ct值的幾何平均數（GM）產生。主要以標準變異系數（SD）和變異相關系數（CV）來判斷基因表達的穩定性，SD和CV的值越小，表明基因表達越穩定。從表2的參數信息可以看出，內參基因18S rRNA在濟寧百日雞下丘腦中表達最穩定，其次是GAPDH，相比而言，β-actin最不穩定；而在卵巢中表達最穩定的內參基因是β-actin，其次是18S rRNA，最不穩定的是GAPDH（見表3）。

表2 Bestkeeper分析內參基因在濟寧百日雞下丘腦中的表達穩定性相關參數Table 2 The expression stability and related parameters of reference genes analyzed by Bestkeeper in Jining Bairi chicken hypothalamus

表3 Bestkeeper分析內參基因在濟寧百日雞卵巢中的表達穩定性相關參數Table 3 The expression stability and related parameters of reference genes analyzed by Bestkeeper in Jining Bairi chicken ovary

3 討論

采用qRT-PCR技術對目標基因表達分析時需要表達穩定的內參基因對反應進行標準化校正，常用的內參基因多為持家基因，但許多研究表明這些持家基因隨組織、細胞或實驗條件的不同而并非恒定表達。研究表明，在缺氧條件下培養24 h的腦星形膠質細胞中GAPDH表達顯著增加，而β-actin表達則明顯下降[3]。在血清刺激實驗中，GAPDH和β-actin表達均顯著升高，不宜用作內參基因，而18S rRNA表達沒有變化[5]。王紅楊等[4]采用RT-PCR和Western blotting技術對雞肌肉組織發育早期階段幾個持家基因進行定量分析，發現GAPDH和β-actin表達水平在所檢測胚齡期的各時間點差異顯著。同樣在豬肺臟、心臟、腎臟、胃、肌肉、脂肪和小腸等組織中對持家基因表達的研究發現，GAPDH在肌肉組織中明顯上調表達[5]。GAPDH是糖酵解途徑中的關鍵酶，腫瘤發生中都會加強此途徑，因此，所研究中若涉及糖代謝變化時則不宜使用GAPDH作為內參，另外，β-actin是細胞骨架肌動蛋白之一，若檢測樣本中有細胞骨架系統發生異常或目標基因參與細胞骨架形成，此時，則不宜使用β-actin作為內參基因[6]。顯然，持家基因的表達并非總是恒定的，若盲目地使用一種看家基因作為內參，可能導致一些基因表達的微小差異難以發現甚至得出錯誤的結論[1]，因此，篩選穩定的內參基因在目標基因表達分析中起著至關重要的作用。

目前，針對雞生殖軸上基因表達的研究中，多以GAPDH、β-actin和18S rRNA為參照基因。楊玉等[7]在分析能量對蛋雞卵巢FSHRmRNA表達中發現β-actin在不同時期和不同能量水平下表達恒定，并以此為內參基因分析FSHR是否受能量水平影響并進一步探究和產蛋率的關系。何晶等[8]對FSHR和LHR在海蘭褐雞卵巢和輸卵管中的定量分析時以GAPDH為內參，張俊珍等[9]研究CDK5基因在蛋雞卵巢中的表達時以18S rRNA為內參基因，朱文奇等[10]研究能量水平對文昌雞下丘腦、卵巢中NPY基因表達的影響時以β-actin為內參基因。而在探究FOXL2與TGFβ家族成員的互作對雞排卵前卵泡顆粒細胞增殖實驗中，則以18S rRNA為內參基因[11]。因此，有必要對這些內參基因在雞發育不同階段下丘腦、卵巢組織中的表達穩定性進行分析。

本研究采用geNorm、NormFinder和BestKeeper 3種軟件，對持家基因18S rRNA、β-actin和GAPDH在濟寧百日雞7個不同發育時期下丘腦和卵巢組織中的表達穩定性分析結果表明：geNorm和NormFinder的分析結果一致，卵巢中β-actin表達最穩定，其次是GAPDH；下丘腦中GAPDH表達最穩定，其次是β-actin。而BestKeeper分析結果顯示卵巢中β-actin最穩定，其次是18S rRNA而不是GAPDH；而下丘腦中最穩定的是18S rRNA，其次是GAPDH。以上差異可能是由于軟件之間運用的算法不同所致。我們對3個內參基因在下丘腦和卵巢中的表達量進行了比較發現：在卵巢中β-actin表達最高，18S rRNA表達最低，而在下丘腦中則相反，表明這些內參基因的表達量存在著組織差異。王忠偉等[12]用geNorm分析籽鵝卵巢組織中內參基因穩定性時發現GAPDH的表達最穩定，并且內參基因的最適數目是2個。平行測定2個或以上內參基因有助于發現偏差，得到獲得更可靠的分析結果[13-15]。根據18S rRNA在卵巢中的穩定性綜合評價，不建議單獨作為內參使用，而在下丘腦中，當研究表達豐度較高的基因時則可以考慮使用。在特定基因的定量研究中，目前還沒有發現適用于對所有樣本進行校正的內參基因。所以，在進行定量分析時，根據樣本的不同，選擇最合適的2個或2個以上的持家基因作為內參，以盡可能消除不穩定因素帶來的影響，從而保證實驗結果的準確性和可靠性，本研究發現，在卵巢及下丘腦中β-actin和GAPDH的相關性最好，可同時作為內參基因配合使用。

4 結論

本研究分析了GAPDH、β-actin和18S rRNA三個常用的內參基因在雞性發育不同階段下丘腦和卵巢組織中的表達穩定性，結果表明，在雞性發育不同階段的卵巢中表達最穩定的內參基因為β-actin，而在下丘腦中為GAPDH。在卵巢中，雖然3個軟件分析β-actin表達穩定性最好，但各內參基因Ct值在樣本間變化較大，即表達均一性較差，因此，建議在雞發育不同時期卵巢的中最好同時選用2個內參基因。

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