芍藥炭疽病病原菌鑒定及其抑菌藥劑篩選

李 麗,劉會(huì)香,宋淑香,郭先鋒*

1.山東農(nóng)業(yè)大學(xué) 林學(xué)院,山東 泰安 271018

2.山東農(nóng)業(yè)大學(xué) 植物保護(hù)學(xué)院,山東 泰安 271018

芍藥炭疽病是嚴(yán)重危害芍藥（Paeonia lactifloraPall.）生產(chǎn)的葉部病害[1,2]，病株葉片的病斑不僅導(dǎo)致葉片光合能力下降，影響植株當(dāng)年的正常生長(zhǎng)及觀賞價(jià)值，而且還嚴(yán)重阻礙芍藥地下芽的發(fā)生及花芽分化，進(jìn)而影響芍藥翌年開(kāi)花數(shù)量及觀賞品質(zhì)。因此，準(zhǔn)確鑒定芍藥炭疽病致病病原菌，篩選出高效抑菌劑，對(duì)于生產(chǎn)實(shí)踐中的科學(xué)防控具有重要研究意義。

關(guān)于芍藥病害研究，多停留于不同地區(qū)病害種類(lèi)調(diào)查及品種抗病性研究方面[3-6]，而對(duì)病原較為系統(tǒng)的鑒定研究較少，僅藍(lán)瑩于上世紀(jì)80年代對(duì)芍藥灰霉病及紅斑病有過(guò)較為細(xì)致的形態(tài)學(xué)鑒定研究[7-8]。關(guān)于芍藥炭疽病病原方面的研究，一直缺乏深入細(xì)致的研究，僅有粗略的病癥描述和病原菌的簡(jiǎn)單介紹[1,2,9]，而缺乏圖文數(shù)據(jù)的支持，為芍藥炭疽病有效防控造成障礙。因此，本研究擬通過(guò)植物病原真菌的分離及形態(tài)學(xué)特征、致病性檢測(cè)以及rDNAITS（Internal transcribed spacer region of the ribosomal DNA）序列分析，明確芍藥炭疽致病病原種類(lèi)，篩選出能有效抑制菌絲生長(zhǎng)的化學(xué)藥劑，為該病害的有效防控提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

病原分離的寄主植物材料采自山東農(nóng)業(yè)大學(xué)林學(xué)實(shí)驗(yàn)站芍藥種植資源圃，寄主芍藥品種主要有‘春曉’、‘大富貴’、‘大葉粉’、‘粉玉奴’、‘紅艷爭(zhēng)輝’、‘蝴蝶戲金花’、‘桃花飛雪’、和‘朱砂判’8 個(gè)品種，通過(guò)形態(tài)調(diào)查結(jié)合病害專(zhuān)家協(xié)同診斷，從其病葉上共分離245塊組織病塊。

1.2 病原菌的分離與純化

病原菌的分離采用常規(guī)組織分離法[10]，分離后菌株于光照培養(yǎng)箱中培養(yǎng)5～6 d，培養(yǎng)條件為28℃，光暗交替12 h/12 h。3次重復(fù)。病原菌的純化采用單孢分離法[11]。純化菌株于4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 致病性測(cè)定

采用離體刺傷接種法，純化的病原物預(yù)先配制為病原菌的孢子懸浮液，濃度為1×106個(gè)·mL-1，清水作對(duì)照，同時(shí)采用無(wú)傷接種作為陽(yáng)性對(duì)照[12,13]。每個(gè)病原物接種時(shí)，均選健康葉片30片，接種病原菌孢子懸浮液100 μL于傷口處，28℃，12 h/12 h光暗交替，保濕培養(yǎng)，2 d后觀察記錄發(fā)病情況，并重新分離發(fā)病組織，檢驗(yàn)分離病原是否與接種病原一致。

1.4 致病菌的形態(tài)鑒定和分子鑒定

將分離純化后的菌株接種于PDA培養(yǎng)基上培養(yǎng)，觀察記錄菌落的顏色、形狀、表面特征、生長(zhǎng)速度等。在顯微鏡下觀察孢子的類(lèi)型、大小、顏色、分生孢子梗特征等。

采用液體培養(yǎng)法培養(yǎng)菌絲；2×CTAB法提取其總DNA；PCR擴(kuò)增采用真菌rDNA通用引物ITS1和ITS4[14]，均由北京華大基因合成，擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)檢測(cè)后純化回收，并送交北京華大基因研究中心有限公司進(jìn)行測(cè)序；將測(cè)序完成的菌株序列提交到NCBI上，并用BlastTn進(jìn)行同源性比對(duì)，確定菌株的分類(lèi)地位。具體方法參照文獻(xiàn)[15]。

為構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)，將已知種屬的序列（表1）與目標(biāo)序列以FASTA格式編輯成為一個(gè)文本文件，用MEGA5.05的Neighbor-Joining法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)，采用自舉法（bootstrap）對(duì)系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)進(jìn)行檢驗(yàn)，共1000次循環(huán)，以保證系統(tǒng)樹(shù)的可靠性。最后將所得系統(tǒng)樹(shù)以EMF的形式輸出保存。

表1 用于系統(tǒng)發(fā)育分析的引用序列Table 1 The reference sequences used in phylogenetic analysis

2 結(jié)果與分析

2.1 病害田間癥狀

芍藥炭疽病主要為害芍藥的葉片。發(fā)病初期的小病斑灰白色似燒焦?fàn)睿韵孪荩L(zhǎng)圓形至圓形，病斑邊緣有時(shí)呈紅褐色（圖1A）；之后病斑邊緣逐漸擴(kuò)大，呈不規(guī)則形輪紋狀，病斑中央淺黃褐色，邊緣深褐色，病斑擴(kuò)展一般不會(huì)跨過(guò)葉脈（圖1B），但有時(shí)會(huì)形成穿孔；發(fā)病后期，植株葉片布滿(mǎn)病斑，病斑上形成黑色小點(diǎn)，為病原菌的子實(shí)體，天氣潮濕時(shí)，黑色小點(diǎn)上溢出橙紅色的孢子團(tuán)。芍藥炭疽病害嚴(yán)重時(shí)，植株會(huì)整株枯萎死亡。

2.2 病原菌的分離

經(jīng)組織分離，從245個(gè)病塊組織中共分離到2種疑似病原菌（表2）。病原菌A157個(gè)，分離率52.0%～76.0%，平均分離率64.1%；病原菌B共57個(gè)。此外，未長(zhǎng)菌落和雜菌31個(gè)，雜菌主要指細(xì)菌。

表2 芍藥炭疽病病原物分離統(tǒng)計(jì)Table 2 Separation Statistics of pathogens from Paeonia lactiflora Pall.anthracnose

2.3 致病性測(cè)定

兩種疑似病原菌的致病性測(cè)定分老葉接種和新葉接種，分別在2013年8月和2014年4月進(jìn)行。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，疑似病原菌A接種在新葉上，無(wú)論有傷接種還是無(wú)傷接種，葉片全部發(fā)病，而且品種間沒(méi)有差異；接種在老葉時(shí)，有傷接種葉片的發(fā)病率為90～100%，無(wú)傷接種葉片的發(fā)病率為80～90%。接種后第2 d一般可觀察到輕微發(fā)病癥狀，7 d后癥狀加強(qiáng)，出現(xiàn)灰色病斑。發(fā)病癥狀與田間發(fā)病癥狀相同。相比之下，疑似病原菌B接種的300片葉片中，僅1片葉片發(fā)病，而高達(dá)99.7%的葉片無(wú)發(fā)病癥狀。將疑似病原菌A接種后的發(fā)病葉片進(jìn)行病原物分離培養(yǎng)，可分離到該病原菌；而從疑似病原菌B接種后的唯一一張發(fā)病葉片中，分離到疑似病原菌A，因此推測(cè)該葉片接種前可能已感染病原菌A且消毒不夠徹底。根據(jù)柯赫氏法則，確定疑似病原菌A為芍藥炭疽病的致病菌，而疑似病原菌B是伴生的非致病菌。圖1C和圖1D分別表示將疑似病原菌A和疑似病原菌B有傷接種到健康新葉2 d后的發(fā)病癥狀。

圖1 芍藥炭疽病的發(fā)病癥狀及病原菌的形態(tài)特征Fig.1 The symptoms and morphological characteristics of Paeonia lactiflora Pall.anthracnose

2.4 致病菌的形態(tài)鑒定

純化培養(yǎng)的致病菌菌株形態(tài)特征一致，早期為白色（圖1E），之后轉(zhuǎn)變?yōu)榛野咨粱疑瑲馍z密實(shí)，菌絲發(fā)達(dá)，毛絨狀，中央漸呈灰黑色（圖1F），有剛毛，一定條件下可產(chǎn)生閉囊殼，培養(yǎng)基背面有灰色色素產(chǎn)生。顯微鏡下，可觀察到炭疽病的病原菌分生孢子盤(pán)生于葉片表皮層下，無(wú)色或褐色，分生孢子梗不分枝，密集，孢子盤(pán)中間或邊緣有剛毛（圖1G），分生孢子橢圓形或圓柱形，單胞，無(wú)色，有隔膜，兩端鈍圓，大小為8～14 μm×2～5 μm（圖1H），附著孢褐色，圓形或不規(guī)則形，產(chǎn)生侵染菌絲，菌絲具有短分枝（圖1I）。由以上形態(tài)可基本鑒定改病原菌為膠胞炭疽菌。

2.5 致病菌的rDNA-ITS序列分析

以致病菌菌株HB的DNA為模板，采用通用引物ITS1和ITS4進(jìn)行PCR擴(kuò)增，獲得一組長(zhǎng)度為533 bp的ITS序列，在GeneBank登錄號(hào)為KR912222。所得序列在NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)中進(jìn)行blast比對(duì)后發(fā)現(xiàn)，其5.8S rDNA及其兩側(cè)ITS序列與序列號(hào)為HQ264179.1的同源性最高，為99%。HQ264179.1序列長(zhǎng)度為550 bp，為膠孢炭疽菌（C.gloeosporioides）。進(jìn)一步構(gòu)建的系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)（圖2）可分為三大分支，其中炭疽菌屬（Colletotrichum）為第一大分支，而供試菌株序列緊密聚在其中，除與登錄號(hào)為KC790967.1、KP748201.1、HQ264179.1、KP900290.1、KT390193.1、KT319051.1、KP689241.1、KT953237.1的序列聚合尤其緊密外，還與草莓炭疽菌（C.fragariae）具有較高同源性；而與該屬其它種（如獨(dú)蒜蘭炭疽菌（C.karstii）、蘭屬炭疽菌（C.cliviae）、菜豆炭疽菌（C.lindemuthianum））等同源性較低，與葡萄座腔菌屬（Botryosphaeria）在不同分支上，充分說(shuō)明供試菌株的ITS序列為膠孢炭疽菌。

根據(jù)病原菌的形體鑒定、致病性鑒定和分子鑒定結(jié)果，芍藥炭疽病的病原菌為膠孢炭疽菌。

圖2 基于rDNA-ITS序列構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)Fig.2 Phylogenetic tree based on rDNA-ITS sequences

3 討論

植物真菌病害的病原鑒定，傳統(tǒng)方法是采用顯微形態(tài)學(xué)鑒定為主，菌落培養(yǎng)特征為輔[15]。但大部分植物菌物的種類(lèi)多、形態(tài)特征復(fù)雜，因而傳統(tǒng)方法極易受分類(lèi)者的分類(lèi)知識(shí)及經(jīng)驗(yàn)等人為影響，常常導(dǎo)致分類(lèi)鑒定的困難[17]。近年來(lái)，以PCR為基礎(chǔ)的rDNA-ITS序列分析由于特異性強(qiáng)、可靠性高，目前在許多植物病原菌鑒定中得到成功應(yīng)用[13,17-19]。形態(tài)特征與rDNA-ITS序列特征相結(jié)合，已發(fā)展為當(dāng)前許多植物病原菌分類(lèi)和鑒定的常用手段。

已如前述，關(guān)于芍藥炭疽病的致病菌，已有文獻(xiàn)報(bào)道只記載發(fā)病癥狀或病原菌的簡(jiǎn)單介紹，描述模糊，缺乏詳實(shí)的圖文數(shù)據(jù)支持，而且存在兩種分歧性說(shuō)法。本研究在病原分離及致病性檢測(cè)的基礎(chǔ)上，通過(guò)形態(tài)鑒定及分子鑒定，一致確定了從芍藥炭疽病病部組織分離到的致病菌為半知菌類(lèi)炭疽菌屬（Colletotrichum）的膠孢炭疽菌，該病原菌與碭山梨[18]、芒果[19]等其它園藝植物炭疽病的病原相同。研究結(jié)果明確了芍藥炭疽病的致病菌，該結(jié)果與喻璋（1987）研究報(bào)道中芍藥炭疽病病原為黑盤(pán)孢科盤(pán)圓孢屬Gloeosporiumsp的論述不同[9]。由于前人文獻(xiàn)報(bào)道中均缺乏詳實(shí)的圖文記錄，我們無(wú)從比較致病菌形態(tài)特征的異同。不過(guò)，由于炭疽菌類(lèi)真菌在屬和種的命名上曾經(jīng)發(fā)生過(guò)重大變更，盤(pán)圓孢屬（盤(pán)長(zhǎng)孢屬）是早期炭疽菌屬使用的異名之一[20]，因此二者有可能是同物異名。

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