酶催化酸性油連續法制備脂肪酸乙酯

張永民，張靜，宋利春 編譯

(1.江南大學；2神華億利能源有限責任公司電廠)

酶催化酸性油連續法制備脂肪酸乙酯

張永民1，張靜2，宋利春2編譯

(1.江南大學；2神華億利能源有限責任公司電廠)

采用從嗜熱真菌（Thermomyces lanuginosus）中提取的Lipozyme TL IM（Novozymes，Seoul, Korea）作為固定化脂肪酶，考察了其催化酸性油與乙醇反應制備脂肪酸乙酯的合成工藝。其中原料酸性油主要是由米糠油精制過程中產生的副產物（皂腳）的酸化獲得。研究了水含量、反應溫度和物料比對該工藝的影響，并對固定化脂肪酶重復利用過程中Lipozyme TL IM的相對活性進行了評價。研究結果表明：反應物中水含量對酯的收率影響很大，最佳含水量為4%；最佳反應溫度是20℃，酸性油/乙醇的最佳物料比為1:4。在最佳工藝條件下，最大收率為92%，產物組成為92%脂肪酸乙酯、3%脂肪酸和5%酰基甘油。通過間歇性的乙醇洗滌工藝可將反應生成的甘油去除，并且脂肪酶在循環使用了27次后依然可以保持82%以上的相對活性。以平均4 h滯留時間計算，Lipozyme TL IM在不進行乙醇洗滌和進行乙醇洗滌兩種工藝中的半衰期分別為39和45次循環。

酸性油；生物柴油；連續反應釜；脂肪酸乙酯；嗜熱菌脂肪酶；酯交換

隨著人們對傳統石油基燃料帶來的一系列環境問題的擔憂，生物柴油作為化石燃料的替代品，日益引起人們的廣泛關注。生物柴油不僅是可重復利用的、生物降解的和相對無毒的，而且排放物中含有的懸浮顆粒和溫室氣體（如CO、CO2、SOx）也很低。同時，生物柴油具有良好的潤滑性能，可以顯著提高發動機效率，延長使用壽命。此外，生物柴油不會產生易燃易爆氣體，閃點高。因此，相對于傳統柴油，生物柴油的運輸、使用和儲存更加安全。

生物柴油主要由脂肪酸單烷酯組成。這些脂肪酸可以來自于植物油，也可以來自于動物脂肪。通過簡單的脂肪酸與短鏈醇間的酯交換反應即可制得生物柴油。

酯交換反應既可通過化學催化實現，也可通過酶催化實現。雖然利用化學催化劑（氫氧化鈉或氫氧化鉀）已經成功制備了生物柴油，但是該工藝卻有無法回避的缺點：副產物甘油難回收和反應結束后必須去除催化劑。相比之下，酶法制生物柴油可以很好地避免這些問題。更為重要的是以脂肪酶作為催化劑，反應條件可以更加溫和，允許水的存在，避免皂的生成，進而提高反應產率。

皂腳是油類精煉過程中的主要副產物，產生于工藝中的中和階段。對皂腳簡單酸化處理，即可得到酸性油。由于米糠油中脂肪酶的高水解活性，使得在米糠油的精煉過程中產生了大量皂腳。因此，米糠皂腳被認為是生物柴油工業的一種理想的低價原料來源。

基于填充床反應器（PBR）的連續操作工藝是一種最適合酶催化脂肪酸反應的工業技術。該工藝的最大優勢就是反應可以在非常短的時間內達到平衡。其次，該工藝非常適宜規模化放大生產，可以有效地將反應產物與固定化催化劑分離，并且固定化酶的穩定性已經得到極大改進，也為該工藝的連續循環操作貼上了低成本的標簽。

到目前為止，Novozym 435、Lipozyme RM IM和Lipozyme TL IM等商品化固定化脂肪酶已在填充床反應器中被應用于各種酶催化反應。其中，提取自嗜熱菌的商品酶Lipozyme TL IM是最廉價的固定化酶之一，它被廣泛應用于生物柴油工業生產。

本文研究了Lipozyme TL IM催化酸性油與乙醇在填充床反應器中的酯交換反應。分別考察了初始水含量、反應溫度和物料比對酶催化酯交換工藝的影響，通過對實驗數據的分析確立最佳工藝參數。在最佳工藝條件下，考察了Lipozyme TL IM的相對活性和甘油對Lipozyme TL IM相對活性的影響。

1 實驗

1.1 試劑

米糠油皂腳（CJ LTE.，Seoul, Korea），固定化嗜熱菌脂肪酶（Lipozyme TL IM，Novozymes，Korea），酶的活性為180,875 U/mg，其他試劑均為分析純。

1.2 酸性油的制備

在配有RZR 2051葉輪混合器（Heidolph,Schwabach, Germany）的3000 mL三口燒瓶內，依次添加100 g米糠油皂腳，300 mL異丙醇，300 mL正己烷和100 mL去離子水。室溫攪拌，邊攪拌邊滴加50 wt%硫酸，直至反應體系的pH降至2～3左右。繼續攪拌1 h后反應結束，靜置。溶液分為上下兩層，用分液漏斗將含有鹽水、異丙醇和其它水溶性物質的下層放出，將含有酸性油和正己烷的上層用熱水反復洗滌，直至水相pH為中性時結束。油相經無水硫酸鈉干燥后通過減壓蒸餾去除溶劑。所得酸性油組成（質量分數）為：（53.7 ±1.3）%脂肪酸，（2.4 ± 0.1）%單甘酯，（9.1 ±1.2）%雙甘酯，（28.8 ± 0.5）%三甘酯和（6.0 ±0.6）%其他物質。酸性油中的脂肪酸主要為棕櫚酸（21.6%），硬脂酸（1.6%），油酸（38.8%），亞油酸（36.5%）和亞麻酸（1.5%）。100 g皂腳大約可獲得54 g酸性油。

1.3 Lipozyme TL IM催化酯交換反應

Lipozyme TL IM催化酸性油與乙醇間的酯交換反應在如圖1a 所示的小型填充床反應器中進行。該反應器由長5.1 cm的不銹鋼管（0.48 cm I.D.）構成。反應物為乙醇和由米糠油皂腳制得的酸性油。固定化Lipozyme TL IM堆積在填充床反應器中。由注射泵(Model 200; KD Scientific, New Hope, Pa., U.S.A.)將反應物連續不斷地從50 mL 玻璃注射器內輸送到反應器中。整個反應器浸沒在水浴中，并用循環水和溫度控制器（Lauda, Lauda-K?nigshofen, Germany）保持溫度的恒定。反應物從底部進入反應器，隨著液面上升將空氣驅趕出去。每次實驗前都應對反應器進行預處理以確保熱平衡和空氣被驅趕干凈，然后收集樣品。

為了獲得最佳的工藝條件，分別研究了水含量、反應溫度和脂肪酸與乙醇物料比在0～6 %，0～40 ℃和1:3～1:6范圍變化時酯交換反應的結果。

圖1 Lipozyme TL IM 催化酯交換反應使用的填充床反應器（PBR）工藝圖

1.4 酶的重復利用

以循環次數作為指標對經過不同程度使用后酶的相對活性進行了評價，進而探究了連續操作工藝下殘留的甘油對Lipozyme TL IM催化酯交換反應的影響。實驗裝置如圖1b所示。實驗在最佳工藝條件下進行，即4%含水量，20℃，脂肪酸與乙醇物料比為1:4，反應物在反應器內滯留時間為4h。采用兩種不同的填充床工藝對比研究了副產物甘油對酶的抑制作用。第一種工藝對反應器中的甘油不作任何處理，作為控制對照工藝；第二種工藝利用改進的裝置增加洗滌步驟，即利用乙醇間歇性地清洗反應器和Lipozyme TL IM固體顆粒，從而將包埋的或吸附的甘油從反應器中去除。對于實驗12、24、36和48，分別用10 mL乙醇來去除甘油。

1.5 分析方法

反應過程中每隔一段時間取出10 mg樣品，將其溶解在1 mL氯仿中，然后采用配有離子火焰檢測器的氣相色譜（Model 3800; Varian, Palo Alto, CA）進行分析。起始時柱溫為120℃，3 min后以20℃/min的速率升溫至370℃，保持5 min。所用氣體為氦氣，流速1.5 mL/min。進樣器和檢測器溫度均保持在370℃。酰基甘油、脂肪酸乙酯和游離脂肪酸的量通過氣相色譜測定。由于游離脂肪酸和脂肪酸乙酯無法通過氣相色譜實現分離，游離脂肪酸的量可通過酸堿中和滴定測量，用0.1 摩爾當量的KOH滴定脂肪酸，以堿性藍（Merck Chemical, Darmstadt, Germany）作為指示劑。脂肪酸乙酯的產率可通過下式計算獲得

a為反應物中脂肪酸乙酯的質量，b是反應物中脂肪酸乙酯、游離脂肪酸和酰基甘油的總質量。

反應物中的水含量通過Karl-Fisher水分測量儀（Model 870 KF Titrino plus; Metrohm AG; Herisau,Switzerland）監測。

1.6 擬合模型

按照固定化酶失活模型分別對對照工藝和改進工藝中的生物催化劑的半衰期進行擬合。為了確定每一個模型的相關性系數，對固定化酶的測量半衰期與估算半衰期的偏差進行了最小化處理。根據下面的殘余活性方程計算酶的估算半衰期：

其中k是反應速率常數（1/time），t是反應物滯留時間（h）。

2 結果與討論

2.1 初始水含量的影響

長久以來，水含量一直被認為是維持酶活性的重要因素。少量水的存在對維持酶的活性是十分有利的；但是，過量的水往往會導致反應的平衡偏離酯交換，而傾向于水解。每一種酶都有各自維持最佳活性所需要的最佳水含量，這與每一種酶的特性是密不可分的。當酶被固定化時，載體對水的親和力也將影響酶的催化活性。因此，最佳水含量與所用的載體也是密切相關的。嗜熱菌脂肪酶分解脂肪的反應在接近無水的條件下的反應速率是非常低的。相比較而言，提取自Candida antarctica的脂肪酶(Novozym 435)卻在水含量非常低的情況下展現出很高的催化活性。

圖2 初始的水含量對經過Lipozyme TL IM 催化酸性油與乙醇的酯交換反應制備脂肪酸乙酯的影響

由于水含量會對酶的幾何結構和立體構型產生影響，因此，以酶作催化劑的填充床反應器中水分的含量通常對酶的穩定性、活性和選擇性產生顯著影響。如何準確測量水分含量就成為了酶催化用填充床反應器設計中必須解決的問題之一。圖2顯示了初始的水含量對經過Lipozyme TL IM催化酸性油與乙醇的酯交換反應制備脂肪酸乙酯的影響。水含量為以反應物為基準的質量百分數，考察范圍為0～6 %，其他反應條件保持不變（30℃，酸性油/乙醇=1:5）。由圖2可知，在實驗的反應時間內，脂肪酸乙酯的產率隨著水含量從0增加4%而逐漸增大。盡管如此，當水含量超過4%以后，脂肪酸乙酯的產率卻基本保持不變。水含量為0時，脂肪酸乙酯的最大產率只有約20%。這主要是因為水含量的增大將提高酶催化水解反應的速率，并可能影響了醇解反應的酶的活性。在酶催化三油酸甘油酯的醇解實驗中也發現了相似的結果。當用嗜熱菌脂肪酶作為催化劑時，醇解反應在無水條件下的反應極其緩慢。這是因為脂肪酶有非常大的限制區域和界面活化作用，與較大的構型變化密切相關。

當水含量為4%時，脂肪酸乙酯的產率在4 h內可以達到最大，約90%。因此，最佳水含量為4%。

2.2 溫度的影響

由于酶的活性和選擇性對溫度非常敏感，因此，研究溫度對酶催化反應的影響十分必要。雖然溫度過高會導致酶失活，但是升高溫度通常會帶來一個加速效應。本實驗固定水含量為4 %和酸性油與乙醇的摩爾比為1:5，考察了溫度在0～40℃范圍內變化時，對經Lipozyme TL IM催化酸性油與乙醇酯交換反應制備脂肪酸乙酯的影響，結果見圖3。由圖3可知，隨著反應溫度從0升至30℃，脂肪酸乙酯的產率不斷增大。繼續升高溫度，脂肪酸乙酯的產率不再增大，反而快速下降。特別是40℃時，脂肪酸乙酯的產率在反應的前2 h內持續增大，但是隨后開始下降。這可能是由于酶的醇解活性在40℃時喪失造成的。盡管Lipozyme TL IM被認為在酸解和酯交換反應中是耐高溫的，但是在乙醇存在下Lipozyme TL IM在40℃以上通常會發生不可逆變性。有文獻報道Lipozyme TL催化天然棕櫚油與甲醇酯交換反應時，脂肪酸酯的產率會隨著溫度的升高而下降，特別是當溫度高于40℃以后。Dizge等也報道了Lipozyme TL催化菜籽油與甲醇酯交換反應時，隨著溫度從40℃升高至70℃脂肪酸酯的產率將從85.8%降低至21.1%。這通常被歸因于酶在溫度超過40℃后的不可逆變性。

由于脂肪酸乙酯在20℃和30℃時所能達到的最大產率沒有明顯差異，所以，從節能的角度考慮，實驗選擇20℃作為反應溫度。

圖3 濕度對酶催化反應中脂肪酸乙酯的產率的影響

2.3 物料配比的影響

固定水含量為4 %和反應溫度為20℃，實驗考察了酸性油與乙醇的摩爾比在1:3 ～1:6范圍內變化時，對經Lipozyme TL IM催化酸性油與乙醇酯交換反應制備脂肪酸乙酯的影響，結果見圖4。當摩爾比為1:3時，脂肪酸乙酯的產率在反應進行4 h后達到平衡，大約78%。此時，反應速率比摩爾比為1:4和1:6時慢。當摩爾比為1:4和1:6時，反應產率幾乎一致。Corrêa等認為酯交換反應產率的下降是由于過量醇的存在，導致酶的活性降低所引起的。因此，在高濃度醇存在下，酶活性和酯交換反應產率的下降很好地反映了醇對水分子與固定化酶的構想之間相互作用的干擾，從而破壞了酶的活性和穩定性。根據以上實驗結果，選擇酸性油與乙醇的摩爾比為1:4作為最佳物料比。此時，脂肪酸乙酯的產率為92%，其余為3%脂肪酸和5%酰基甘油。

根據以往的研究可知，Lipozyme TL IM是一種1,3-配位的脂肪酶，它可以水解三酰甘油中1位和3位的酯鍵，故理論上的最達產率為66.67 %。但是我們卻獲得92%的產率，這是因為酸性油中含有大量游離脂肪酸（約54%），它們可以完全轉化為脂肪酸乙酯。

圖4 酸性油與乙醇的摩爾比對于經Lipozyme TL IM 催化酸性油與乙醇酯交換反應制備脂肪酸乙酯的影響

2.4 固定化酶的重復利用

固定化酶的最大優勢就是其穩定性和可重復利用性。固定化酶的使用壽命已然成為評價工藝經濟成本的重要指標。實驗考察了最佳工藝條件（水含量為4%，反應溫度為20℃，酸性油與乙醇的摩爾比為1:4，反應物滯留時間4 h）下，Lipozyme TL IM在填充床反應器中進行連續化酯交換反應過程的穩定性，并且對比研究了在兩種不同的填充床反應工藝中甘油的抑制作用，結果見圖5。第一個工藝作為對照體系，對反應中生成的甘油不作任何處理。相比之下，第二個工藝中加入一個間歇性洗滌操作單元。每循環生產12次(48 h)后，用乙醇將甘油除去。在這兩種工藝中，固定化脂肪酶均保持了其對脂肪酸乙酯的高催化活性，即使進行了18次循環后。但是，如果進一步增大循環次數，從18次增加到27次，控制對照工藝中酶的相對活性降低較大，為66%；然而，增加了乙醇沖洗操作的工藝中酶的活性降低較小，依然可以達到82%。控制對照工藝中，Lipozyme TL IM的半衰期為39次循環，而乙醇沖洗工藝中Lipozyme TL IM的半衰期為45次循環。通過酶失活模型估算得到的在兩種工藝中Lipozyme TL IM半衰期分別為40.5次循環和45次循環。二者的吻合度非常好。

當酶被連續使用后，它的相對活性會有所降低。作為三酰甘油與乙醇酯交換反應的產物，甘油是其中最重要的原因所在，它已經被確認是一種酶抑制劑。Salis等人對此給出了可能的抑制作用機理。首先，甘油在酶表面的吸附導致了酶中所含水的活度降低。其次，甘油在酶表面形成的吸附層阻礙了疏水反應物向酶的活性位點的擴散。Li等也報道了在無溶劑法酶催化制備脂肪酸乙酯工藝中，大量甘油被吸附在固定化脂肪酶的表面，導致了酶的使用壽命的縮短。Watanabe等認為甘油可以擾亂反應物向酶的擴散，從而導致反應速率隨著未反應醇濃度的增大而降低。實驗結果也證實了酯交換反應中生成的甘油抑制了Lipozyme TL IM的反應活性。盡管如此，用乙醇對生物催化劑進行間歇性沖洗可以從填充床反應器中有效地去除甘油，從而提高酶的使用壽命。

圖5 Lipozyme TL IM在填充床反應器中進行催化酯交換反應過程的相對活性

3 結論

以Lipozyme TL IM作為催化劑，在填充床反應器中實現了從米糠油皂腳酸化制得的酸性油和乙醇的酯交換反應制備脂肪酸乙酯的高效合成。水含量、反應溫度和物料比對脂肪酸乙酯的產率有顯著影響。通過乙醇沖洗可以明顯提高脂肪酶的相對活性。

（譯自《J Am Oil Chem Soc》19 January 2016）

Synthesis of Fatty Acid EthyI Ester from Acid OiI in a Continuous Reactor via an Enzymatic Transesterification

Nakyung Choi1,2· Yangha Kim3· Jeom?Sig Lee4· Jieun Kwak4· Junsoo Lee5·In?Hwan Kim1,2

Synthesis of a fatty acid ethyl ester via the lipase-catalyzed transesterification of acid oil and ethanol was investigated in a continuous reactor. Lipozyme TL IM was employed as the immobilized lipase. This immobilized lipase derived from Thermomyces lanuginosus was purchased from Novozymes (Seoul, Korea). The acid oil was prepared by the acidification of soapstock formed as a byproduct during the refining of rice bran oil. The parameters investigated were water content,temperature, and molar ratio of substrates. The relative activity of Lipozyme TL IM was assessed during the repeated use of the immobilized lipase. The water content of the substrate had a considerable effect on the yield and the optimum water content was 4 %. The optimum temperature and molar ratio of acid oil to ethanol were 20 °C and 1:4, respectively. The maximum yield of approximately 92 % was achieved under the optimum conditions. The corresponding compositions were 92 % fatty acid ethyl esters, 3 % fatty acids, and 5 % acylglycerols. When glycerol formed during the reaction was removed by intermittent washing with ethanol, the relative activity of lipase was maintained over 82 % for a total usage of 27 cycles. For a mean residence time of 4 h, the half-life times of Lipozyme TL IM on the control (unwashed) and treatment (washed) were 39 and 45 cycles, respectively.

acid oil; biodiesel; continuous reactor; fatty acid ethyl ester; thermomyces lanuginosus lipase; transesterification