聚對苯二甲酸-己二酸丁二酯(PBAT)降解菌的分離鑒定和降解能力測定

(1.新疆農業科學院微生物應用研究所/新疆特殊環境微生物實驗室，烏魯木齊 830091；2.新疆農業科學院土壤肥料與農業節水研究所，烏魯木齊 830091)

doi:10.6048/j.issn.1001-4330.2017.11.016

聚對苯二甲酸-己二酸丁二酯(PBAT)降解菌的分離鑒定和降解能力測定

霍向東1，高 雁1，林 青1，曾 軍1，張 濤1，楚 敏1，楊紅梅1，史應武1，王 斌2，孫九勝2，王金鑫2

(1.新疆農業科學院微生物應用研究所/新疆特殊環境微生物實驗室，烏魯木齊 830091；2.新疆農業科學院土壤肥料與農業節水研究所，烏魯木齊 830091)

目的研究能夠降解聚對苯二甲酸-己二酸丁二酯(Poly(butylene adipate-co-terephthalate)，PBAT)的微生物及其降解能力。方法以PBAT粉末為唯一碳源，從南疆疏勒縣鋪覆PBAT生物降解膜的土樣中分離可有效降解PBAT聚合物的微生物，利用16S rDNA 序列對比分析進行菌株鑒定。采用失重法和掃描電鏡觀察，測定菌株的降解能力。結果從土壤中分離獲得一株能夠明顯降解PBAT聚合物的細菌XJSL2，經16S rDNA 序列分析鑒定為Sphingopyxisginsengisoli，經過60 d培養，該菌株對PBAT顆粒的實際降解率達到0.92%。結論菌株XJSL2能夠顯著降解PBAT聚合物，對于PBAT的再生利用具有潛在應用價值，土壤中還存在著大量能夠降解PBAT的微生物。

聚對苯二甲酸-己二酸丁二酯；生物降解；Sphingopyxisginsengisoli

0 引 言

【研究意義】隨著農業現代化的不斷發展，地膜已成為節水、防除雜草等確保農業高產穩產的重要手段之一。20世紀70年代末，中國引入地膜覆蓋技術，隨著地膜產品和覆膜方式的不斷改進，我國地膜使用量和覆膜面積持續增加，2014 年我國地膜用量達到144.1×104t，覆蓋面積超過1 800×104hm2，但是隨著地膜覆蓋使用年限的增加和殘膜回收率低，土壤中殘膜量逐步增加，一些農田的地膜殘留量超過250 kg/hm2，已造成嚴重的白色污染[1, 2]?？缮锝到獾啬ぜ染哂袀鹘y地膜的功能和特性，又可以在完成功能使命后被環境微生物分解，已成為傳統地膜的理想替代品[3, 4]?！厩叭搜芯窟M展】有許多聚合物薄膜生物降解方面的相關研究。當前研究主要集中于可降解聚羥基丁酸酯(poly(3-hydroxybutyrate) ，PHB)、聚己內酯(polycaprolactone，PCL)、聚己二酸亞乙基酯(poly(ethylene adipate) ，PEA)、聚己二酸丁二醇酯(Poly(1,4-butylene adipate)， PBA)、聚乳酸(Polylactic acid ，PLA)、聚丁二酸丁二醇酯(poly (butylene succinate)，PBS)等微生物源及合成聚合物的降解微生物分離與降解特性研究[5, 6]。聚對苯二甲酸-己二酸丁二酯(Poly(butylene adipate-co-terephthalate)，PBAT)是己二酸丁二醇酯和對苯二甲酸丁二醇酯(poly(butylece terephthalate)，PBT)的共聚物，兼具PBA和PBT的特性，既有較好的延展性和斷裂伸長率，也有較好的耐熱性和沖擊性能[7]。PBAT作為優良的生物降解材料已應用于醫藥、片材、地膜、包裝、發泡等領域[8]?！颈狙芯壳腥朦c】目前大量的研究主要集中于PBAT的合成及改性[9-12]，而針對PBAT 降解菌株的分離篩選及降解特性的研究較少[13-16]。研究聚對苯二甲酸-己二酸丁二酯(PBAT)降解的分離鑒定和測定降解能力?！緮M解決的關鍵問題】挖掘高效降解PBAT的菌株，研究其降解特性，提高環境中PBAT的降解效率，對其作為生物塑料薄膜的推廣應用及其殘留的生物修復。

1 材料與方法

1.1 材 料

南疆疏勒縣鋪覆PBAT生物降解膜的土樣；PBAT顆粒，由新疆康潤潔環?？萍加邢薰咎峁?；PBAT粉末，PBAT顆粒冷凍粉碎成細小顆粒并過特定目數篩網。

LB培養基(g/L)：蛋白胨 10，酵母粉 5，NaCl 5，pH 7.0，121℃滅菌30 min。

MSM培養基(g/L)：K2HPO41，KH2PO40.2，(NH4)2SO41，MgSO4·7H2O 0.5，NaCl 1，FeSO4·7H2O 0.01，CaCl2·2H2O 0.002，MnSO4·H2O 0.001，CuSO4·5 H2O 0.001，ZnSO4·7H2O 0.001，pH 7.0，121℃滅菌30 min。

篩選培養基：MSM培養基添加1%PBAT粉末。

1.2 方 法

1.2.1 PBAT降解菌的分離

取1 g土樣稀釋到10-5，取100 μL涂布篩選培養基，30℃培養72 h后，挑取培養基上生長的菌落。

1.2.2 分子鑒定

采用細菌通用引物：27F 5′-AGAGTTTGATCMTGGCTCAG-3′與1492R 5′-TACGGYTACCTTGTTACGACTT-3′。PCR擴增反應體系:上下游引物(50 pmol/μL)各0.5 μL，2×PCR mix(含Taq酶1.25 U/25 μL) 25 μL，模板DNA 2 μL，無菌ddH2O補足50 μL，陰性對照為不加模板。PCR條件：94℃ 4 min；94℃ 1 min，55℃ 1 min，72℃ 2 min，30個循環；72℃ 10 min。PCR產物由新疆昆泰銳生物技術有限公司進行測序。

利用BLAST 軟件，將測到的16S rDNA 序列與EzBioCloud[17]數據庫進行序列比對分析,進行同源性比較。利用MEGA6軟件應用鄰接法(Neighbor-Joining) 構建系統發育樹[18]。

1.2.3 失重法測定菌株降解PBAT的能力

培養基的PBAT顆粒和培養基分開處理。100 mL MSM 培養基在 121℃ 條件下濕熱滅菌 20 min，樹脂顆粒利用干熱滅菌法(105℃ 烘箱連續烘數天)。0.8～1.0 mm樹脂顆粒添加到培養基前精確稱取其質量M始。每瓶接4 mL LB培養基中培養24 h的菌液，設3組重復，對照組不加菌液，30℃，150 r/min培養60 d。降解培養結束后，用蒸餾水反復清洗收集的樹脂顆粒，洗凈后于50℃烘箱中放置3 d，精確稱量M末。利用IBM SPSS Statistics 22.0進行統計分析。

樹脂顆粒降解率(%)=(M始-M末)/M始×100%。

1.2.4 電鏡觀察

降解實驗后的PBAT顆粒經噴金處理后，利用掃描電子顯微鏡(SEM， S-570，Japan-Hitachi Ltd，加速電壓20 kV)觀察表面形態特征。

2 結果與分析

2.1 16S rDNA序列的同源性比較及系統發育樹

以菌株XJSL2基因組DNA為模版，采用細菌通用引物進行PCR擴增，得到1 347 bp的PCR產物。菌株XJSL2的16S rDNA序列GenBank登錄號(MF461626)。經與EzBioCloud數據庫中序列進行Blast相似性分析，XJSL2菌株與SphingopyxisginsengisoliGsoil 250菌株(AB245343)[19]的核苷酸序列同源性達100%。利用MEGA6.0 軟件采用Neighbor-joining 法構建系統發育樹，結果顯示菌株XJSL2與SphingopyxisginsengisoliGsoil 250菌株(AB245343)聚為一簇，說明它們與菌株XJSL2的親緣關系最近，可確定該菌株為Sphingopyxisginsengisoli。圖1

圖1 菌株XJSL2系統進化樹
Fig.1 The phylogenetic tree of strain XJSL2

2.2 降解PBAT的能力

PBAT顆粒在無菌條件下保持0.48%左右的失重率，說明PBAT顆粒在無菌條件下不發生降解，0.48%的失重率是因為液體培養基浸泡及高溫烘干的作用。PBAT顆粒經過 XJSL2 菌株60 d的降解作用，PBAT顆粒的降解率達到1.4%，與對照差異顯著，扣除空白降解，菌株XJSL2對PBAT顆粒的實際降解率為0.92%。圖2

2.3 PBAT顆粒表面SEM觀察

經降解培養，取出PBAT顆粒洗凈，在50°C烘箱中烘干后利用SEM觀察顆粒表面的變化情況。圖3A(原始顆粒)和3B(對照組，無菌液體處理)的 PBAT顆粒表面平整，二者表面沒有發生明顯變化；圖3C(降解組，菌株XJSL2降解處理后)的PBAT顆?？汕逦吹筋w粒表面結構被破壞，表面形成細微坑洞。PBAT材料在自然環境中的分解是物理、化學與生物的共同作用過程，相比自然環境，單菌株液體搖瓶的降解作用有限，所以在較短時間內，PBAT顆粒不能完全被分解破壞，只在表面發生了細微變化。圖3

圖2 菌株XJSL2降解PBAT的能力
Fig.2 The degrading capability of XJSL2

圖3 (A)原始PBAT粉末顆粒 (B)無菌培養液中的對照PBAT粉末顆粒 (C)菌株XJSL2處理后的PBAT粉末顆粒
Fig.3 (A) Initial PBAT particle (B) PBAT particle in medium without microbia (C) PBAT particle in medium with strain XJSL2

3 討 論

生物降解塑料是指在自然環境及微生物的生物、物理多重作用下能夠降解或分解的可塑性材料。生物降解塑料按生產合成方式的不同可分為：天然高分子型生物降解塑料、微生物合成型生物降解塑料、化學合成型生物降解塑料、共混型生物降解塑料等四類[20, 21]。PBAT即屬于化學合成型生物降解塑料，由于其分子中芳香族PBT鏈段的存在而增加了PBAT的降解難度。研究者主要從堆肥及厭氧環境中分離到一些PBAT降解微生物及從微生物中克隆能夠分解PBAT的酶，如Witt分離自堆肥的耐熱放線菌Thermomonosporafusca， 55℃條件下，99.9%的PBAT粉末22 d后被降解[22]、Biundo從厭氧菌PelosinusfermentansDSM 17108克隆了可降解PBAT的脂肪酶[14]、Perz從厭氧菌ClostridiumhathewayiDSM-13479分離到可降解PBAT的酯酶Chath_Est1[23]。最近，有研究者也從土壤中分離到一些中溫PBAT降解微生物，如Kasuya從土壤中分離到了能夠降解PBAT的3株真菌和2株細菌，其中降解速度最快的菌株NKCM1712 與玫煙色棒束孢(Isariafumosorosea)的親緣關系相近，10 d的PBAT薄膜(1 cm×1 cm×100 um)降解率為8.4%，細菌NKCM2511、NKCM2512的10 d PBAT薄膜降解率分別為1.4%和1.2%[24]。Muroi從土壤中分離到3株與Bacilluspumilus親緣關系較近的可降解PBAT的細菌，其中菌株NKCM3201的降解能力最強，10 d的PBAT薄膜(1 cm×1 cm×100 um)降解率為1.2%[13]。菌株XJSL2對PBAT的降解能力與真菌菌株NKCM1712、細菌菌株NKCM2511、NKCM2512、NKCM3201相比有一定差距，該差異可能與測試所用材料的不同有關。Wallace利用蛋白質組篩選技術從Pseudomonaspseudoalcaligenes中發現一種能夠降解PBAT的酯酶PpEst[16]。Lee從韓國種植人參的土壤中分離到SphingopyxisginsengisoliGsoil 250菌株。如前所述，能夠分解PBAT的微生物主要來源于土壤和堆肥。由于土壤中約90%～99.9%的微生物仍是未培養的[25]，土壤中一定孕育著大量還未被分離到的能夠降解PBAT的微生物。

4 結 論

分離到一株能夠降解PBAT的細菌菌株XJSL2，經16 S rDNA序列進化分析，其親緣關系與Sphingopyxisginsengisoli菌株 Gsoil 250最近，可確定菌株XJSL2屬于Sphingopyxisginsengisoli。經液體培養60 d后，菌株XJSL2對PBAT顆粒的實際降解率可達0.92%，其降解PBAT的特性與降解產物有待進一步的深入研究。菌株XJSL2在以PBAT為主要原料的生物降解薄膜的再生利用中具有潛在應用價值。

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IsolationandidentificationofPoly(butyleneadipate-co-terephthalate) -degradingBacteria

HUO Xiang-dong1, GAO Yan1, LIN Qing1, ZENG Jun1, ZHANG Tao1, CHU Min1,YANG Hong-mei1, SHI Ying-wu1, WANG Bin2, SUN Jiu-sheng2, WANG Jin-xin2

(1.ResearchInstituteofAppliedMicrobiology/XinjiangSpecialEnvironmentalMicrobiologyLaboratory,XinjiangAcademyofAgriculturalSciences,Urumqi830091,China; 2.ResearchInstituteofSoil,FertilizerandAgriculturalWaterConservation,XinjiangAcademyofAgriculturalSciences,Urumqi830091,China)

ObjectiveTo isolate poly (butylene adipate-co-terephthalate)-degrading bacteria and study the capability of biodegradation of the bacteria.MethodUsing PBAT powder as the sole carbon source to isolate Poly (butylene adipate-co-terephthalate)-degrading bacteria from the soil which was covered with PBAT mulch. The strain was identified by 16S rDNA sequence comparative analysis. The degradation capability of strain in the liquid medium was evaluated by weight loss method and scanning electron microscope.Result1 Poly (butylene adipate-co-terephthalate) - degrading bacteria was isolated and identified asSphingopyxisginsengisoli. In the liquid medium, degradation rate of PBAT reached up to 0.92% after 60 days.ConclusionTheSphingopyxisginsengisolistrain XJSL2 can be used to recycle of PBAT mulch. There are still a lot of soil microorganisms able to degrade PBAT, This still needs further research.

poly (butylene adipate-co-terephthalate); biodegradation;Sphingopyxisginsengisoli

Supported by: The Key Research and Development Program of Xinjiang Uygur Autonomous Region "Biodegradable Plastic Film Innovation Project"(2016B02017-4); The National Natural Science Foundation of China"Metagenomic Library Construction of the Rumen Microbe from Xinjiang Bactrian Camel and cellulase Family Research" ( 31160027)；The Special Funding for Enhancing the Agricultural Scientific and Technological Research Innovation Platform of Xinjiang Academy of Agricultural Sciences-Xinjiang Laboratory of Special Environmental Microbiology"(XJNKYPT-2017-002)

Huo xiang-dong(1974-),male,Gansu province,associate professor,microbial resources,(E-mail)xiangdonghuo@163.com

S188

A

1001-4330(2017)11-2086-06

2017-09-30

新疆維吾爾自治區重點研發項目“生物降解地膜創新工程”(2016B02017-4); 國家自然科學基金項目“新疆雙峰駝瘤胃微生物宏基因組文庫構建和纖維素酶系的研究”(31160027)；“新疆農業科學院農業科技創新平臺能力提升建設專項-新疆特殊環境微生物實驗室”(XJNKYPT-2017-002)

霍向東(1974-)，男，甘肅人，副研究員，研究方向為微生物資源，(E-mail)xiangdonghuo@163.com