恩度促進(jìn)與肺癌細(xì)胞A549共培養(yǎng)體系中的HUVEC凋亡及其機(jī)制研究

馬 芬, 馮 鋒

(江蘇省南京明基醫(yī)院 腫瘤科, 江蘇 南京, 210019)

恩度促進(jìn)與肺癌細(xì)胞A549共培養(yǎng)體系中的HUVEC凋亡及其機(jī)制研究

馬 芬, 馮 鋒

(江蘇省南京明基醫(yī)院 腫瘤科, 江蘇 南京, 210019)

恩度; 肺癌細(xì)胞A549; HUVEC凋亡; 機(jī)制

本研究對(duì)恩度促進(jìn)與肺癌細(xì)胞A549共培養(yǎng)體系中的HUVEC凋亡及其機(jī)制進(jìn)行了研究，現(xiàn)報(bào)告如下。

1 材料與方法

1.1 材料

購(gòu)買煙臺(tái)麥得津生物工程有限公司生產(chǎn)的重組人血管內(nèi)皮抑制素，購(gòu)買中國(guó)科學(xué)院上海細(xì)胞庫(kù)提供的人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞HUVECs、人非小細(xì)胞肺癌A549細(xì)胞株，購(gòu)買湖南長(zhǎng)沙長(zhǎng)錦科技有限公司生產(chǎn)的CO2培養(yǎng)箱，購(gòu)買杭州四季青公司生產(chǎn)的批號(hào)為110213的胎牛血清，購(gòu)買武漢博士德生物工程有限公司生產(chǎn)的Bax, Bcl-2抗體、鏈霉素親和生物素酶復(fù)合物(SABC), 購(gòu)買南京凱基生物公司生產(chǎn)的Annexin V2FITC凋亡檢測(cè)試劑盒，購(gòu)買日本Olympus IX71倒置熒光顯微鏡奧林巴斯BX51熒光顯微鏡，購(gòu)買新加坡ESCO公司生產(chǎn)的超凈工作臺(tái)，購(gòu)買GIBCO生產(chǎn)的DMEM與RPMI1640培養(yǎng)基，購(gòu)買美國(guó)Sigma公司生產(chǎn)的3-(4, 5-二甲基噻唑-2)-2, 5-二苯基四氮唑溴鹽(MTT), 購(gòu)買日本Osaka Takeda公司生產(chǎn)的O-(氯乙酰-氨基酰基)煙曲霉醇(TNP-470), 購(gòu)買美國(guó)Moleculor Devices生產(chǎn)的SPECTRAmax190酶聯(lián)分析儀, Corning Transwll遷移小室直徑、孔徑分別為6 mm、5 μm。

1.2 方法

1.2.1 A549細(xì)胞與HUVECs細(xì)胞共培養(yǎng)體系的建立: 將對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的A549取出來(lái)，對(duì)其進(jìn)行消化，在此過(guò)程中將0.25%胰腺充分利用起來(lái)，在RPMI-1640培養(yǎng)基中加入，將A549單細(xì)胞懸液制備出來(lái)，密度為2×104細(xì)胞/mL。同時(shí)將對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的HUVECs細(xì)胞取出來(lái)，對(duì)其進(jìn)行消化，在此過(guò)程中將0.01%EDTA充分利用起來(lái)，在RPMI-1640培養(yǎng)基中加入，將HUVECs單細(xì)胞懸液制備出來(lái)，密度為1×105細(xì)胞/mL。分別在A549細(xì)胞、HUVECs上接種6孔板Transwell小室的上室、下室，在RPMI-1640培養(yǎng)基中加入，其含10%胎牛血清，培養(yǎng)成分為100 U/mL鏈霉素+100 U/mL青霉素，以使上室細(xì)胞培養(yǎng)在培養(yǎng)基中得到切實(shí)有效的保證。在37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中對(duì)Transwell板進(jìn)行培養(yǎng)。

1.2.2 恩度共培養(yǎng)體系中對(duì)HUVECs生長(zhǎng)抑制作用: 在下室HUVECs長(zhǎng)到75%～85%融合度的情況下，用含藥培養(yǎng)基處理細(xì)胞。恩度的濃度分別為10、20、40、80、100 μg/mL, 陽(yáng)性對(duì)照組為終濃度為25 μg/mL的TNP-470, 空白對(duì)照組加100 μL培養(yǎng)基代替，另將對(duì)照孔設(shè)置為本底，其屬于無(wú)細(xì)胞培養(yǎng)液，體積同上，含有相應(yīng)濃度藥物，每組將3個(gè)平行孔設(shè)置起來(lái)。進(jìn)行2 d的孵育后將每孔的含藥血清棄去，將1 mL不含血清的培養(yǎng)基重新加入，另將20 μL 5 mg/mL的MTT液加入，在培養(yǎng)箱中進(jìn)行4 h的孵育，將液體棄去，將100 μL二甲基亞砜(DMSO)加入每孔，在振蕩器中進(jìn)行10 min的振蕩，在580 nm波長(zhǎng)處采用酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀對(duì)OD值進(jìn)行測(cè)定，計(jì)算出生長(zhǎng)抑制率，方法為對(duì)照組與實(shí)驗(yàn)組OD值之差與對(duì)照組OD值的百分率，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.2.3 HUVECs凋亡測(cè)定: 對(duì)細(xì)胞進(jìn)行接種，并對(duì)其進(jìn)行藥物處理，然后進(jìn)行2 d的培養(yǎng)，對(duì)細(xì)胞凋亡進(jìn)行測(cè)定，在此過(guò)程中將Annexin V-FITC試劑盒充分利用起來(lái)，用胰酶-EDTA消化下室HUVECs細(xì)胞，將細(xì)胞收集起來(lái)，將消化終止，在此過(guò)程中將培養(yǎng)基充分利用起來(lái)。每個(gè)樣本計(jì)數(shù)1×104細(xì)胞。對(duì)收集的細(xì)胞進(jìn)行2遍的潤(rùn)洗，在此過(guò)程中將冷的PBS充分利用起來(lái)，用500 μL結(jié)合緩沖液懸浮細(xì)胞，將5 μL Annexin V-FITC加入其中，以輕柔的動(dòng)作混勻。測(cè)定前將5 μL PI加入其中，同時(shí)在暗處放置，進(jìn)行15 min的避光反應(yīng)。上機(jī)測(cè)定，每組平行2個(gè)樣本。

1.2.4 恩度對(duì)HUVECs中Bcl-2與Bax凋亡蛋白的影響檢測(cè): 對(duì)恩度對(duì)共培養(yǎng)體系中HUVECs中Bcl-2與Bax凋亡蛋白的影響進(jìn)行評(píng)價(jià)，在此過(guò)程中將鏈霉親和生物素酶復(fù)合物(SABC)方法充分利用起來(lái)。將HUVECs接種在玻片上，恩度的濃度為10、20、40 μg/mL。進(jìn)行2 d的培養(yǎng)后用PBS對(duì)細(xì)胞進(jìn)行3次清洗，每次1 min，室溫下對(duì)4%多聚甲醛進(jìn)行90 min的固定，進(jìn)行3次洗滌，在此過(guò)程中將PBS充分利用起來(lái)，每次2 min。進(jìn)行30 min的處理，在此過(guò)程中將H2O2充分利用起來(lái)，進(jìn)行3次洗滌，在此過(guò)程中將PBS充分利用起來(lái)，每次2 min, 然后在37 ℃的溫度下對(duì)10%封閉血清進(jìn)行20 min的孵育。將1∶200 Bcl-2與1∶200 Bax抗體加入其中，在37 ℃的溫度下進(jìn)行2 h的孵育，之后將二抗加入其中，進(jìn)行20 min的孵育，用PBS洗滌，對(duì)樣本進(jìn)行處理，在此過(guò)程中將SABC溶液充分利用起來(lái)。最后用0.3 mg/mL 3, 3′-二氨基聯(lián)苯胺(DAB)處理，鏡下對(duì)反應(yīng)時(shí)間進(jìn)行控制，輕度復(fù)染、洗滌、封片，在此過(guò)程中分別將蘇木素、PBS、中性樹(shù)膠充分利用起來(lái)。采用Image-ProPlus圖像分析軟件鏡下拍片。陰性對(duì)照組用PBS將一抗取代掉。

1.2.5 Bcl-2與Bax蛋白檢測(cè): 進(jìn)行Western blotting, 對(duì)細(xì)胞進(jìn)行消化并將其收集起來(lái)，在此過(guò)程中將胰酶-EDTA充分利用起來(lái)，將400 μL裂解液加入其中前將冰冷PBS加入其中進(jìn)行3次潤(rùn)洗，在冰上放置對(duì)細(xì)胞進(jìn)行30 min的裂解。在4 ℃離心機(jī)中進(jìn)行離心，速率和時(shí)長(zhǎng)分別為14 000 r/min、5 min, 將上清液提取出來(lái)，對(duì)蛋白質(zhì)濃度進(jìn)行測(cè)定，然后進(jìn)行SDS-PAGE轉(zhuǎn)膜。室溫下對(duì)TBST進(jìn)行1 h的封閉，在此過(guò)程中將含5%胎牛血清白蛋白(BSA)充分利用起來(lái)，將Bcl-2與Bax抗體加入，在4 ℃溫度的搖床過(guò)夜。將1∶1 000 HRP-IgG二抗加入其中雜交，洗膜后顯色。在凝膠成像系統(tǒng)中放置，分析Bcl-2與Bax蛋白的相對(duì)表達(dá)量。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

應(yīng)用統(tǒng)計(jì)軟件SPSS 16.0分析所得數(shù)據(jù)，用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示所有數(shù)據(jù)，各組數(shù)據(jù)組間差異比較用One-way ANOVA方差分析，檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05。

2 結(jié) 果

恩度對(duì)HUVECs增殖抑制作用、誘導(dǎo)HUVECs細(xì)胞凋亡情況分析見(jiàn)表1。恩度對(duì)HUVECs中Bcl-2與Bax蛋白表達(dá)的影響分析見(jiàn)表2。

表1 恩度對(duì)HUVECs增殖抑制作用、誘導(dǎo)HUVECs細(xì)胞凋亡情況分析

與正常組比較, *P<0.05; 與TNP-470比較, #P<0.05。

表2 恩度對(duì)HUVECs中Bcl-2與Bax蛋白表達(dá)的影響分析 %

與空白組比較, *P<0.05; 與TNP-470比較, #P<0.05。

3 討 論

重組人血管內(nèi)皮抑制素注射液(恩度)屬于一種血管內(nèi)皮生長(zhǎng)抑制劑，特點(diǎn)為新型、多靶點(diǎn)，能夠?qū)δ[瘤血管生成進(jìn)行抑制，在多種腫瘤的治療中均得到了有效應(yīng)用[1-3]。相關(guān)醫(yī)學(xué)研究[6-8]表明，恩度能夠?qū)ρ苌杉澳[瘤生長(zhǎng)、侵襲、遷移進(jìn)行抑制，途徑為在腫瘤微血管內(nèi)皮細(xì)胞特異性地作用。近年來(lái)，在腫瘤患者的發(fā)病率及死亡率中，肺癌在日益加重的環(huán)境污染、吸煙等因素的影響下已經(jīng)位居首位[9]。通常情況下，恩度是臨床治療肺癌過(guò)程中通常采用的藥物[10]。現(xiàn)階段，很多相關(guān)醫(yī)學(xué)研究均對(duì)恩度對(duì)血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子、成纖維生長(zhǎng)因子等的表達(dá)進(jìn)行調(diào)控進(jìn)行了報(bào)道，但是卻很少有相關(guān)醫(yī)學(xué)研究對(duì)恩度對(duì)血管內(nèi)皮細(xì)胞凋亡的影響進(jìn)行報(bào)道。

本研究結(jié)果顯示，恩度對(duì)HUVECs增殖抑制率、誘導(dǎo)HUVECs細(xì)胞凋亡率均隨著濃度的提升而提升(P<0.05), 10、20 μg/mL恩度對(duì)HUVECs增殖抑制率、誘導(dǎo)HUVECs細(xì)胞凋亡率均顯著低于25 μg/mL TNP-470(P<0.05), 80、100 μg/mL恩度對(duì)HUVECs增殖抑制率、誘導(dǎo)HUVECs細(xì)胞凋亡率均顯著高于25 μg/mL TNP-470(P<0.05), 但40 μg/mL恩度、25 μg/mL TNP-470對(duì)HUVECs增殖抑制率、誘導(dǎo)HUVECs細(xì)胞凋亡率之間的差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05), 20、40、80、100 μg/mL恩度、25 μg/mL TNP-470誘導(dǎo)HUVECs細(xì)胞凋亡率均顯著高于正常組(P<0.05), 但10 μg/mL恩度、正常組誘導(dǎo)HUVECs細(xì)胞凋亡率之間的差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05); 免疫細(xì)胞化學(xué)、Western blotting下20、40 μg/mL恩度、25 μg/mL TNP-470對(duì)HUVECs中Bcl-2蛋白表達(dá)均顯著低于空白組(P<0.05), Bax蛋白表達(dá)均顯著高于空白組(P<0.05), 10 μg/mL恩度對(duì)HUVECs中Bcl-2蛋白表達(dá)均顯著高于25 μg/mL TNP-470(P<0.05), Bax蛋白表達(dá)均顯著低于25 μg/mL TNP-470(P<0.05), 但20、40 μg/mL恩度、25 μg/mL TNP-470對(duì)HUVECs中Bcl-2與Bax蛋白表達(dá)差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05), 10 μg/mL恩度、空白組對(duì)HUVECs中Bcl-2與Bax蛋白表達(dá)差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05), 說(shuō)明恩度促進(jìn)與肺癌細(xì)胞A549共培養(yǎng)體系中的HUVEC凋亡的機(jī)制為對(duì)Bcl-2家族蛋白進(jìn)行調(diào)控。

[1] 許成云, 倪慶桂, 樊馨, 等. 重組人血管內(nèi)皮抑制素對(duì)肺微血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖及其周期分布的影響[J]. 臨床腫瘤學(xué)雜志, 2009, 14(5): 410-413.

[2] 李忠義, 劉江秋, 徐璐, 等. 重組人血管內(nèi)皮抑制素對(duì)小鼠Lewis肺癌腫瘤抑制作用[J]. 中國(guó)腫瘤生物治療雜志, 2003, 10(4): 274-276.

[3] 殷宗寶, 王洪武, 鄧超, 等. 重組人血管內(nèi)皮抑制素注射液對(duì)低O2高CO2肺動(dòng)脈高壓大鼠IL-6, eNOS, VEGF 的影響[J]. 實(shí)用醫(yī)學(xué)雜志, 2010, 26(18): 3311-3313.

[4] 辛慶鋒, 俊輝. 冬凌草甲素抗腫瘤作用機(jī)制研究進(jìn)展[J]. 醫(yī)學(xué)綜述, 2008, 14(3): 455-456.

[5] 王玉彬, 李迪諾, 岳莉. 重組人血管內(nèi)皮抑制素對(duì)人胃癌MGC-803細(xì)胞株VEGF表達(dá)的影響[J]. 江蘇醫(yī)藥, 2011, 37(13): 1504-1506.

[6] 張春玲, 吳立軍, 左海軍, 等. 冬凌草甲素通過(guò)改變Bax/Bcl-xL表達(dá)激活caspase-3誘導(dǎo)A375-S2細(xì)胞凋亡[J]. 中國(guó)藥理學(xué)通報(bào), 2004, 20(6): 669-672.

[7] 蔡魯平, 蔡瑞興, 翟繼萌. Glubran2膠介入栓塞在肺癌咯血中的應(yīng)用效果[J]. 實(shí)用心腦肺血管病雜志, 2014, 22(10): 93-95.

[8] 王志強(qiáng). sFRP、WIF-1、CD133、CD44在肺癌組織中的表達(dá)及其臨床意義[J]. 實(shí)用心腦肺血管病雜志, 2014(02): 8-9.

[9] Feng L, Xu Y H, Wang S S, et al. Preventative Effects of 4, 4′-Diphenylmethane-bis(methyl) Carbamate Isolated from Cortex Mori on Human Umbilical Vein Endothelial Cell Dysfunction Induced by Advanced Glycation End Products[J]. Phytother Res, 2012, 26(3): 412-419.

[10] ZHANG Y, WU Y, Tashiro S, et al. Involvement of PKC signal pathways in oridonin-induced autophagy in HeLa cells: a protective mechanism against apoptosis[J]. Biochem Biophys Res Commun, 2009, 378(2): 273-278.

R 734.2

A

1672-2353(2017)23-081-03

10.7619/jcmp.201723026

2017-06-28