淺析微生物分子生物學的鑒定方法

以往對微生物分子生物學鑒別的方式，通常以微生物的理化性質與形態進行甄別，該方法存在的弊端是鑒定過程復雜且耗時。最近幾年以來，由于分子生物學的發展迅猛，更精準、更科學、更簡捷的方法被挖掘而出——PCR技術。在分子生物學中，可增添PCR技術，譬如：在分析自動核糖體間隔基因分布、單鏈結構的多態性與變性方面，其效果十分顯著。本論文著重闡述了多種有關于微生物分子生物學的甄別方式及其利弊之處。

最近幾年，越來越多的科學家開始對微生物分子生物學進行探究，因為技術的落后，導致部分實驗備受阻隔。微生物分子生物學鑒定方法的產生，讓人類能夠以種屬的關系，繼而對不同的水生真核微生物實行區分，然而對于原核微生物而言，探究不多。由于原核微生物外形不大且種類繁多，不可進行人工培育。因而，鑒定出是原核微生物的概率極小。值得一提的是基于微生物分子生物學鑒定方法之下，為進一步鑒定原核微生物的種類與外在特征提供了一條捷道。在本論文之中，主要探究了不同水生微生物的分子生物學鑒定方式，簡單說明了PCR概念，核心在于闡述PCR技術、不依賴PCR技術的方法。

一、涉及PCR的分子生物學方法

對于生物科學而言，PCR技術的出現使得生物學有著突飛猛進的改變，也增強了人類進一步探究微生物的信心，目前，因為強大的敏感度、特異性PCR技術為探究微生物奠定了堅實基礎。由于PCR擴增技術的不斷升級，使得多種科學的、敏感度強、先進的方法也59c3beb2817975fd5ccf4cdd99bd8913逐漸被研發。譬如：實時熒光PCR、觸減PCR、嵌套PCR、最小循環數PCR、反轉錄PCR等。在此之中，實時熒光PCR擴增技術能夠以定量方面來鑒定微生物的類別，當然該方式的可測定任何周期內微生物的狀態，其也可對靶基因進行篩選與提取。假如總DNA中的靶基因含量不少，PCR擴增技術很快就能完成鑒定任務。在基于反轉錄PCR擴增技術之下，為了獲取較多的目的基因，可采用獨特的引物進行擴增。對于RT-PCR而言，其可視為敏感度高、活性強的擴增技術，其能夠鑒定較多的RNA活性組織。對于觸減PCR 擴增技術而言，在各個階段中退火溫度會一直呈遞減趨勢，但是退火的初始溫度高于Tm，之后也呈遞減趨勢。此種方式效果明顯且效率高。當前，對于微生物分子生物學的鑒定方法來講，毫無疑問PCR擴增技術是最理想、最優化、最迅速的鑒定方式之一，然而其自身存在一定的弊端。

二、基于PCR的分子生物學方法

2.1 克隆文庫中的隨機測序

對于克隆文庫中的隨機測序來講，首先是基于PCR擴增技術下對生成物的克隆，之后正式進入克隆文庫中的隨機測序。經過隨機測序之后，可初步鎖定PCR擴增生成物里的優勢進行數據備份，將測序與文庫數據進行對照，通過比對之后確定并剖析該類微生物特性與已知微生物特性的異同之處，繼而鑒定微生物的類別。克隆文庫中的隨機測序實驗首次是由國外學者Giovannoni 所提出，并采用該技術對16SrDNA進行精準定位，檢測出海底細菌的多樣性。國外學者Zwart等人對歐洲等地區進行了類似實驗，研究發現淡水細菌基本遍布了全世界。

2.2 隨機擴增多態DNA

隨機擴增多態DNA具體指的是應用多種單鏈作為引物，隨機分配，然后通過基因組的DNA實行PCR擴增，最后達到鑒定微生物的多樣性。當遺傳特性出現改變之時，對各個隨機引物均實行PCR 擴增操作，致使生成物出現明顯差異，因為采用大量的隨機引物，最終全部基因組的差異表現的十分顯著。在此之中，運用單一隨機引物，對精準性不高且呈現多態的DNA實行PCR擴增的時候，能夠與靶DNA的多個位點實行隨機退火處理，換句話說，隨機引物與DNA之間的序列不能互補。部分DNA帶能夠通過隨機引物，在退火處理之下進行反向擴增。即使隨機擴增多態DNA技術反應靈敏，然而其存在的弊端在于可重復性、穩定性欠佳。因而，雖然隨機擴增多態DNA技術效果良好，但使用條件相對于其他方法更加苛刻，并未得到普及。

三、不涉及PCR的分子生物學方法

3.1 熒光原位雜交技術

熒光原位雜交技術具體指的是基于核酸序列之上，檢測細胞內和特異互補核酸序列之間的融合情況，，并采用帶有熒光的探針進行監控。帶有熒光的探針能夠設置為一類物種特異，其可被視為界特異的互補序列、特異序列。因為探針具備一定的滲透性，繼而細胞可被良好的固定及處理，讓探針得以在特異位點處準確實行雜交技術。通常來講，對細菌特殊基因組、細菌特異性兩處的探針是共同發力的。通過雜交技術之后，可采用熒光顯微鏡來觀察微生物。雖然熒光原位雜交技術存有巨大優勢，在探究普通樣品的時候，之所以誤差依然存在，是因為測驗受探針的選取、周圍環境、熒光染料等多方面的影響。

3.2 DNA聯合剖析技術

DNA聯合剖析技術具體指的是應用單一群體之中的差異序列進行對比或兩個生物群體之中的所有DNA序列進行逐一對比。針對以上兩類方式，均需對群體的所有DNA實行提純，將某一個群體的DNA標記為放射性且視為鏈模板。兩類DNA樣品之中出現交叉性雜交的均被使用，當然相似度也可被準確識別。為了進一步探究序列的分布，將要對DNA相似序列、DNA變性單鏈實行聯合分析，最終識別DNA性質與基因組的數量。

四、結論和展望

對于PCR技術來講，避免了去創建克隆基因文庫這一環節，可以說該技術變得更加科學，因而在鑒定微生物群體多樣性的時候，PCR技術提供了巨大幫助。但是該類技術僅可單純的識別物種的類別，并不能細致的分析微生物的生態與代謝情況。目前，對于分子生物學的探究還未達到成熟階段，在之后的研究之中可能研發更加高效的新興技術，進一步探究微生物的生態功能、代謝情況以及生物多樣性。

（作者單位：延安大學西安創新學院）