基于原子力顯微鏡的不同固化液對腎細胞固化狀態的影響

摘 要：細胞固化技術是利用介質將活細胞固定在反映溶液中，且盡可能完整的保存細胞的原有結構。針對細胞固定過程中遇到的細胞破裂、細胞過渡收縮、細胞核固定性差等問題，本文采用原子力顯微鏡對甲醇、戊二醛、丙酮固定的腎細胞進行形貌測量。經對比分析發現戊二醛對腎細胞的固化能夠更完整的保存細胞的原有結構。

關鍵詞：細胞固化；原子力顯微鏡；細胞測量

DOI：10.16640/j.cnki.37-1222/t.2017.24.251

1 引言

原子力顯微鏡是通過檢測待測樣品表面和一個微型力敏感元件之間的極微弱的原子間相互作用力來研究物質的表面結構及性質。它可以實現對樣品的“推”、“拉”、“刻劃”、“切割”、“搬運”等操作功能[1]。還可以實現樣品的表面成像、粗糙度測量、高度測量等檢測功能。傳統觀測細胞的儀器為光學顯微鏡，其分辨率在微米級別，且不能準確的得出所觀測細胞的尺寸、粗糙度、高度等信息。而原子力顯微鏡具有納米級分辨率，可在空氣或者各種近生理條件下工作，直接探測生物細胞的高度、直徑、體積、彈性等信息，能夠在微/納尺度上更加詳細地了解和掌握生物細胞的表面形貌、結構特征、功能及特性等。這種優勢使其正逐漸發展為細胞生物學研究中的有效工具。但是，因細胞具有一定的柔性，直接在生理溶液中對細胞進行原子力顯微鏡成像，會有成像分辨率不高、細胞膜表面蛋白成像不穩定等缺點。因此為獲得較高的細胞表面成像的分辨率，我們常會利用固化劑對細胞進行固化處理，雖然經固化劑處理后，細胞失去了活性，但對于細胞骨架、細胞膜表面褶皺、細胞器、微絨毛等研究卻有不可或缺的作用。

2 固化細胞形貌成像

傳統的細胞固定劑有95%酒精、乙醚酒精液、甲醇、冰醋酸、無水酒精、丙酮、Carnoy固定液、10%中性緩沖甲醛液等多個種類。但由于乙醚、丙酮等具有揮發性和毒性，對人身體有害，已很少用于常規細胞學的固定。常用的細胞固定劑多為醛類固定劑，且以甲醛類和戊二醛最為常用。本文采用最常用的固定劑，丙酮、2.5%戊二醛、甲醇對腎細胞進行固定，并獲得固定后的腎細胞形貌圖像。

2.1 生理溶液下觀察腎細胞

正常腎細胞是在37攝氏度環境中，貼壁生長于培養液中。本實驗是將貼壁生長兩天的腎細胞從培養箱中取出，并更換新的培養液。更換培養液是不可或缺的重要步驟，可以防止細胞生長過程中死亡的漂浮細胞或雜質刮到探針針尖上，影響實驗結果。圖1為正常生理溶液下腎細胞形貌圖像。可見細胞伸展狀態良好，細胞表面較光滑，細胞之間通過觸角聯系密切。但掃描過程中會有拉線情況出現，影響成像質量。

2.2 觀察2.5%戊二醛固定劑固化的腎細胞

2.5%戊二醛固定劑是常用的細胞固定劑，該固定劑固定速度快、穿透性強，可以很好的保存細胞的微細結構。2.5%戊二醛固定劑配制方法：量取25%的戊二醛溶液10ml，置于三角燒瓶中，加入雙蒸餾水40ml，0.2mol/L磷酸緩沖液50ml，充分混勻[2]。圖2為2.5%戊二醛固定劑固化后的腎細胞形貌圖像。可見2.5%戊二醛固定劑處理后的腎細胞，表面相對平滑，沒有明顯的孔洞，細胞邊緣較清晰。與正常生理溶液下觀察到的腎細胞形貌圖像差別不大。

2.3 觀察甲醇固定劑固化的腎細胞

甲醇固定劑具有固定時間快，細胞收縮小，細胞核保存較好，結構清晰等優點。圖3為甲醇固定劑固定后的腎細胞形貌圖像。圖4為

（下轉第278頁）

（上接第275頁）

甲醇固定劑固定腎細胞后，腎細胞的邊緣形貌圖像。由甲醇固定劑處理后的腎細胞形貌圖可見，細胞表面侵蝕出許多孔洞樣結構。說明甲醇侵蝕了腎細胞的細胞膜，使腎細胞產生了損傷。從圖4可以清晰的看到細胞的邊緣細微結構，說明腎細胞的微絨毛固化的相當清晰完好。

2.4 觀察丙酮固定劑固化的腎細胞

丙酮處理后的腎細胞形貌如圖5所示。可清晰的觀察到細胞表面有多處皸裂的痕跡，且細胞邊緣不清晰，說明細胞脫水嚴重，在固化的過程中受到極大的損傷。由圖6可見，細胞邊緣觸角收縮為一團。與正常生理溶液中的活細胞相比，經丙酮固化后的腎細胞形貌結構變化較大。

3 結論

細胞形貌、結構與細胞的生理狀態和功能有著重要的聯系，原子力顯微鏡對細胞表面形貌學研究與臨床研究的關系越來越密切，并具有廣闊的應用前景。本文通過原子力顯微鏡對生理溶液下腎細胞、2.5%戊二醇固定劑固定的腎細胞、甲醇固定劑固定的腎細胞、丙酮固定劑固定的腎細胞進行形貌測量。經對比分析發現甲醇固定劑會很好的固定細胞邊緣的細微結構，但是卻會侵蝕細胞表面，使細胞表面產生孔洞樣結構。丙酮固定劑會使細胞脫水嚴重，細胞表面會發生皸裂，且細胞邊緣觸角會收縮成團，腎細胞形貌較生理溶液中的細胞變化較大。而2.5%戊二醛固定劑對腎細胞的固化能夠更完整的保存細胞的原有結構，使細胞更接近于生理溶液中活細胞的形貌結構狀態。根據實驗結果顯示，對于進一步研究細胞的亞結構，如細胞膜結構的褶皺，細胞表面的層狀脂肪物，微端絲和微絨毛[3]等，2.5%戊二醛固定劑固定細胞樣品是很好的細胞樣品制備方式。

參考文獻：

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[2]莊樂南，齊浩，孫潤廣.不同固定條件下細胞與活細胞的原子力顯微鏡實時觀察[J].生物物理學報，2005，21（05）：345-349.

[3]吳愛國，魏剛，李壯.原子力顯微鏡技術對生物樣品的研究[J]. 分析化學，2004，32（11）：1421-1425.

作者簡介：張文曉（1988-），女，滿族，吉林梅河口人，碩士研究生，實習研究員，研究方向：納米操縱及測量。endprint