甘草細胞生物反應器連續培養的探討

楊豐源 沈陽科技學院

甘草細胞生物反應器連續培養的探討

楊豐源 沈陽科技學院

當今社會，生物反應器的種類越來越多，對于不同種類的植物，要采取不同的植物組織培養體系，設計適合這種植物的生物反應器，從而達到預期的培養效果。本文簡單的介紹了甘草細胞在生物反應器中連續培養的過程，包括前期材料的準備，以及培養液中殘糖的測定，得出了甘草細胞培養生長動力學和營養物質消耗動力學等相關結論，以供甘草細胞的生物反應器放大培養提供參考。

甘草細胞 生物反應器 殘糖

甘草的藥用在世界范圍內有著悠久歷史，而中國對于甘草的采集和藥用歷史更是長達將近五千年之久。甘草在中國傳統醫學領域中有著很高的地位，根據傳統中醫理論的相關記載，甘草可以使其他中草藥的藥用功效得到加強，所以在幾乎所有的中醫藥方成分里都存在甘草。目前，由于甘草資源的減少，甘草行業面臨著巨大的挑戰，利用植物的組織培養技術和細胞培養技術對甘草進行大規模培養工作迫在眉睫。

1.材料和方法

1.1 前期材料的準備

甘草懸浮細胞系需要經過四次的懸浮繼代培養，所培養出來的第四代甘草細胞可作為接種材料，應用在生物反應器之中，并選用自行研發設計出的連續攪拌式生物反應器系統，來實現甘草細胞的放大培養，同時還要選取已經除去連續給養系統之外的相同類型的生物反應器進行甘草細胞的培養。在對照培養方面，則要選取生長狀態良好的搖瓶式培養。從甘草細胞進行接種的第一天開始，每隔三天進行一次取樣，一直持續到培養工作完成為止。所取的樣品要放在低溫的環境中保存，以用于對培養液底物中糖、銨根離子、磷酸根離子、硝酸根離子濃度的測定。在每次進行取樣的同時，還要使用JPBJ-608測定培養液的溶氧值，使用PHS-3C精密pH計測定培養液的pH值。所取的樣品在經過低溫離心處理之后，上層清液要收集并加以保存，下層使用濾膜進行真空抽濾處理，稱量出樣品的濕重，然后使用60攝氏度的烘箱烘烤24小時至恒重狀態，稱量出樣品的干重。

1.2 培養液中殘糖的測定

測定培養液中糖的殘余量，首先要制備出標準曲線。取出50mg經過干燥處理的葡萄糖標準品，向其中加水使其成為1.0mg/mL的葡萄糖標準液。從中精密量取出0.1mL～1.0mL的標準液，并放置在10mL的容量瓶中，使用蒸餾水將其稀釋到刻度線位置，搖勻之后精密取出1mL，放到刻度試管里，然后加5%苯酚液約1mL和5mL的濃硫酸，在室溫狀態放置40分鐘，以1mL的蒸餾水、1mL的苯酚液、5mL的濃硫酸混合液根據上述的操作做空白。在UV-2201紫外可見分光光度計中，在490nm處測定出吸收度，對所測出的數據進行線性回歸計算，回歸方程是Y=9.533x-0.0141(R2=0.9916)。

2.結果與討論

2.1 甘草細胞培養生長動力學

在液體培養基里面添加生長激素及褐化抑制劑的過程中，甘草懸浮細胞可以安全存活和生長，且生長的速度很快。同固體培養基中愈傷組織的生長情況相比，懸浮培養方式的延滯期要短很多。在固體培養基內，愈傷組織在生長時由于和培養基的接觸面積相對較小，其傳質的效率較低；而懸浮培養時的傳質效率則要比愈傷組織高很多，其延滯期也相對較短。在搖瓶培養方式和生物反應器的批量培養方式中，隨著懸浮培養細胞的進行，細胞的生物量也在不斷增加，在培養液中的營養元素也會大量消耗掉，溶氧量越來越少，同時由于細胞在生長中逐漸出現破裂、消亡等狀況，培養到后期之后存活的細胞生物量也會大量下降。

2.2 營養物質消耗動力學

細胞培養所使用的培養基在滅菌過程中，蔗糖由于受熱會分解成葡萄糖和果糖，之后果糖會再次轉化成葡萄糖，最終都是以葡萄糖的存在形式被植物細胞給吸收和利用。葡萄糖在進入到植物細胞中之后，一部分會成為細胞結構物質的組成部分，另一部分會由于呼吸作用成為能源和碳源以供細胞生命活動所用。在搖瓶培養和反應器分批培養的前21天，糖會逐漸被甘草細胞在代謝和生長過程中所吸收和消耗，細胞生物量會隨之增加，培養基中的糖濃度也會隨之減少，這些都體現出了碳源的重要性。造培養21天之后，糖的濃度開始呈現上升的趨勢，這是由于部分細胞發生了自溶所導致的。在反應器進行連續灌注的培養中，糖濃度會在第六天到第十八天有一定幅度的降低，這說明這個時間段內糖的代謝速率在加快，這和甘草細胞生物量在快速積累有關。

綜上所述，這種以過程的變量和參數恒定不變作為培養目的的操作方式，在甘草細胞的培養過程中能夠以改變影響細胞生長的營養成分組成來對細胞代謝的活性變化和組成進行研究，這種穩定形態的甘草細胞也能根據質量的平衡來給培養過程中反應動力學的速率及參數測定提供便捷。研究人員們需要繼續在甘草細胞的生物反應器培養工作進行放大實驗，從而給甘草的大規模生產提供幫助。

[1]李雅麗，孟婷婷，王毛毛，李曉雪，李蓉蓉，郭曉強.甘草細胞在攪拌式生物反應器中的放大培養[J].植物生理學報，2015，51(03):302-306.(2015-03-24)[2017-08-17].

[2]郭松波.甘草細胞反應器培養及活性成分分析[D].天津科技大學，2013