基層獸醫實驗室ELISA試驗中常見問題的分析與應對

摘 要：酶聯免疫吸附測定（Enzyme-linked Immuno Sorbent Assay，ELISA）試驗目前成為獸醫實驗室最重要、使用最頻繁、最廣泛的血清學檢測方法。操作過程中涉及環節和細節相對較多，若掌握得不太熟練或不理解實驗原理，將直接影響檢測結果的準確性。本文主要從樣本、試劑、加樣、溫育、洗板、顯色和酶標儀等方面分別進行了闡述和分析，對科學全面系統掌握本檢測方法、提高檢測結果的準確性和提升基層實驗室檢測能力具有一定的指導意義。

關鍵詞：ELISA；樣本；溫育；顯色；質量控制

中圖分類號：S855.3 文獻標志碼：C 文章編號：1001-0769（2017）07-0092-03

酶聯免疫吸附測定（Enzyme-linked Immuno Sorbent Assay，ELISA）具有靈敏度高、特異性強、重復性好、自動化程度高和安全等優點，已成為動物疫病預防控制系統各級獸醫實驗室使用最頻繁、最廣泛、最重要的血清學檢測方法，在動物疫病診斷檢測工作中發揮著舉足輕重的作用。然而，從各實驗室檢測和人員技術掌握情況看，對ELISA特別是口蹄疫液相阻斷ELISA檢測操作過程中各環節的操作細節掌握和重視不夠，發生顯色不全、顯色過深、跳孔、非特異性顯色和花板等現象仍然較為頻繁，使檢測結果受到較大影響。之所以發生上述現象，最主要的原因是各種操作失誤所致，包括沒有掌握相關知識和不按要求操作兩類。另有極少部分是由于水質量不達標引起的，除此之外還有少量失敗案例是由于設備使用不當或透光不良引起的。筆者將操作中各環節出現的最為普遍的問題和對策總結如下，供大家參考。

1 樣本采集或處理不當造成的假陽性和假陰性及對策

首先，樣本避免溶血，溶血樣本會釋放出具有過氧化物酶活性的物質，此物質的存在可能以辣根過氧化物酶為標記的ELISA測定非特異性顯色增加，結果呈假陽性。對策是溶血樣本作為不合格樣本不予檢測。

其次，樣本避免被細菌污染，因為菌體中含有的內源性辣根過氧化物酶可能會造成假陽性反應。對策是懷疑被污染樣本作為不合格樣本不予檢測。

最后，樣本凍融后，蛋白質分布不均，吸取樣本時若未吸到抗體蛋白可能會形成假陰性反應。對策是對凍融樣本采取輕緩上下顛倒混勻，切忌在混勻器上強烈振蕩。

2 試劑使用方面存在的問題和對策

第一，試劑從冰箱拿出來立即使用，試劑溫度未恢復到室溫，抗原抗體作用的溫度達不到反應需要的溫度需求。對策是把冷藏試劑從冰箱拿出后平衡至室溫方可使用（密封的反應板在平衡時應根據需要拆開包裝）。

第二，試劑盒使用后未及時放回冰箱。對策是試劑盒使用后應及時放回冰箱。

第三，發現濃縮洗液有結晶析出而不做處理。對策為采用溫箱或水浴加熱的辦法，使結晶物完全溶解后再稀釋使用。

3 加樣環節存在的問題和對策

第一，移液器加樣時，吸取不同試劑瓶液體時未換槍頭。對策為吸取不同的液體應及時更換槍頭。

第二，移液器吸取液體時速度太快而產生氣泡，使吸取的液體量不足。對策為放慢吸取液體的速度。

第三，向酶標孔中加液體時，槍頭插入太深而接觸到孔內液體，造成污染，或由于槍頭的毛細作用使部分液體不能流出而造成誤差。對策為打完液體后及時更換槍頭。

第四，酶標板加完液體后晃動不均勻，造成作用不充分和顯色不全。對策為每加完一次液體應將酶標板放在桌子上平行輕輕搖晃30 s，使液體充分混勻，保證作用充分和顯色全面。

4 溫育環節存在的問題和對策

第一，酶標板在溫育前忘記用封板膜密封，溫育過程中反應體系緩慢蒸發，使抗原抗體吸附于孔壁，難于清洗徹底，造成顯色過深。對策為溫育前用封板膜密封反應板。

第二，溫育時溫箱溫度或室溫達不到要求，造成顯色不全成假陰性。對策為開始試驗前開啟并設定溫箱溫度，在溫育前用溫度計進行測定；室溫溫育時，在實驗前開啟空調，使室溫達到溫育所需溫度。

第三，溫育時酶標板疊放在溫箱，疊放過多造成中間的酶標板板溫育溫度不夠，而使溫育不徹底，造成顯色不全而出現假陰性；還可能使ELISA的邊緣效應加劇。對策為酶標板最好不要疊放，若疊放建議不要超過3塊。

5 洗板過程存在的問題和對策

第一，手工洗板時孔與孔之間液體交叉，造成相互污染，使陰性樣本變為陽。對策為洗板時孔內加液不要過多，防止液體溢出，向孔內打液體時，盡量避免因用力過猛而產生氣泡。

第二，洗板機洗板時洗液瓶洗液太少，造成洗板不能完成。對策為洗板前給洗液瓶加滿洗液并隨時檢查洗液瓶洗液液位。

第三，洗板機洗板針吸液不暢或堵塞，因抽吸不完全造成洗板不徹底。對策為洗板前檢查洗板機，保證每個針孔通暢。

第四，用洗板機洗板時未調整好微孔液體殘余量，余量超過2 μL易導致洗板不干凈和產生假陽性結果，造成洗板不徹底。對策為調整洗板機吸液量和打出液體量，發現針頭堵塞要及時疏通。

第五，交叉使用不同項目的洗滌液造成洗板不徹底或洗脫。對策為采用專用的洗板液洗板。

第六，每批反應板過多，反應板過多會造成洗板等待時間延長，使洗板不徹底。對策為每次實驗時不要做過多的板，每批最好控制在20個板以內。

6 顯色過程存在的問題和對策

第一，顯色劑配制過早或使用過期的顯色劑，這樣均會造成顯色不全。對策為最后一次洗板時配制顯色劑，不使用過期顯色劑。

第二，有A、B兩種液體為顯色底物的，由于兩種液體不穩定，使用保存不當會產生顏色而對結果產生影響。對策為使用時發現有顏色必須啟用新的底物，加顯色液時應先加A液后加B液。顯色時間嚴格執行說明書規定。

第三，加顯色劑時液體濺出孔外形成液體回流，造成跳孔。對策為加顯色液時盡量避免液體濺出孔外形成液體回流。

第四，反應板較多時，盡量爭取同一時間顯色。時間對顯色很重要，反應板較多時，加樣、洗板和溫育等操作都延長，均會使結果偏差加大。對策為具體操作時，應盡量爭取同一時間顯色，加樣的時間越統一，結果誤差越小。

7 酶標儀

第一，環境潮濕的實驗室，酶標儀長期放置后濾光片可能會發生霉變。對策為使用前應檢查濾光片，發現濾光片霉變時可用擦鏡紙小心擦拭，并核對濾光值。

第二，加入終止液后直接測OD值，可能會造成顯色不均勻和跳孔。對策為加入終止液后，反應板進倉后設置測量前震蕩混勻3 s以上后開始檢測，以保證顯色均勻和防止跳孔。

8 質量控制

實驗室質量控制體系的成功運行對檢驗結果的準確性有直接影響。做好室內質量控制對ELISA試驗來說非常重要，而室內質量控制主要是借助室內質量控制血清來進行的。因此，有條件的實驗室，應自己制備室內質量控制血清。每次檢測時與普通樣本同時進行。質量控制血清的低值（弱陽性-臨界值）監測是檢測精密度觀察的最敏感窗口。同時也是提示試驗成功與否的最重要標志。但要注意的是不能把弱陽性-臨界值質控物作為判斷結果的準質量控制血清，同時要避免對其反復凍融而造成質量控制血清變性。

9 結語

總之，在ELISA檢測具體操作過程中，應注意避免對溶血樣本進行檢測，必須保證試劑平衡至室溫，選擇量程與吸取樣本量接近的移液器加樣，嚴格控制溫育所需的溫箱溫度（或室溫），嚴格按照檢驗操作規程或說明書操作。同時要掌握ELISA原理，清楚每項操作步驟的目的和意義，注重操作細節，反復練習，做到熟能生巧，才能把ELISA試驗做好、做準確、做精。同時要按照實驗室管理體系文件中的表格文件做好檢測結果的記錄，保證記錄內容真實、信息全面、格式規范。