免疫復(fù)合物疫苗用于雞新城疫病毒感染的研究

摘 要：以雞新城疫病毒上海株sh09作為抗原，與雞新城疫卵黃抗體IgY按照一定的比例配置免疫復(fù)合物疫苗。用無特定病原雞進行免疫分組試驗，實驗分為對照組、滅活苗組、免疫復(fù)合物疫苗組3組，每隔1周取雞測定血凝抑制（Hemagglutination Inhibition，HI）抗體效價。攻毒實驗在免疫實驗的基礎(chǔ)上增加1組常規(guī)弱毒苗組。結(jié)果表明，制備的復(fù)合物疫苗在雞體內(nèi)HI抗體效價上升較顯著，其免疫效果比常規(guī)疫苗好，能很好地應(yīng)對強毒株的攻擊。

關(guān)鍵詞：雞新城疫病毒；免疫復(fù)合物疫苗；免疫效果

中圖分類號：S831.7 文獻標(biāo)志碼：A 文章編號：1001-0769（2017）08-0078-03

雞新城疫（Newcastle Disease，ND），又稱亞洲雞瘟、偽雞瘟等，是由雞新城疫病毒（Newcastle Disease Virus，NDV）引起的一種急性高度接觸性傳染病。典型的ND特征為體溫升高，食欲減退，垂頭縮頸或翅膀下垂，病雞咳嗽，呼吸困難，嗉囊內(nèi)充滿液體內(nèi)容物，常有酸臭液體從口內(nèi)流出，有的病雞還伴有神經(jīng)癥狀，下痢，泄殖腔出血、壞死，腺胃乳頭、腺胃和肌胃交界處以及十二指腸出血，慢性病例常有呼吸道癥狀或神經(jīng)癥狀[1]。雖然現(xiàn)在通過疫苗接種預(yù)防該病，但NDV的傳染還是經(jīng)常發(fā)生，嚴重影響家禽養(yǎng)殖業(yè)的發(fā)展，當(dāng)前該病仍是最主要和最危險的禽病之一[2]。目前，控制該病的主要措施是通過接種疫苗，但不論是滅活苗還是活疫苗都各有優(yōu)缺點，而且新基因型的出現(xiàn)也使常規(guī)疫苗的作用變得不明顯[3]。免疫復(fù)合物疫苗具有高度的抗原性，既能誘導(dǎo)體液免疫也能刺激細胞產(chǎn)生免疫應(yīng)答反應(yīng)，是一種新型疫苗[4]。本研究將抗原與抗體按照特定比例混合，即被動免疫與主動免疫相結(jié)合，立即并長久地保護動物免受病原微生物的感染，在免疫措施、方法、劑量等方面進行研究，探討其可行性，并通過動物攻毒試驗評價免疫復(fù)合物疫苗的保護效果。

1 材料與方法

1.1 毒株及試劑

NDV上海株sh09、LaSota株和F48E9病毒均由上海市農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧獸醫(yī)研究所禽病實驗室保存。PEG-8000、硫酸銨均購自上海實驗試劑有限公司。Taq DNA 聚合酶、Trizol-A+ 總RNA提取試劑均購自上海皓嘉有限公司。9～10日齡的無特定病原體（Specific Pathogen Free，SPF）雞胚購自北京梅里亞維通實驗動物技術(shù)有限公司。

1.2 抗原及滅活苗的制備

以NDV上海株sh09為種毒，按常規(guī)方法經(jīng)尿囊腔接種9～10日齡的SPF雞胚[5]。24 h后照蛋，棄掉死亡的雞胚，其余放入孵育箱，在48 h～60 h 內(nèi)再次照蛋，將活的雞胚放入4 ℃冰箱，24 h后取出收獲其尿囊液，用血凝（Hemagglutination，HA）試驗測定其血凝效價。血凝效價大于1︰28的尿囊液經(jīng)檢驗合格后保存?zhèn)溆谩?/p>

以上制備的抗原加入0.2%的甲醛，經(jīng) 42 ℃水浴12 h以獲得滅活苗。

1.3 卵黃抗體IgY的制備

用1.2方法制備的滅活苗免疫SPF產(chǎn)蛋雞4次后，收集產(chǎn)下的雞蛋，用PEG-8000和硫酸銨沉淀制備卵黃抗體（IgY）。用血凝抑制（Hemagglutination Inhibition，HI）試驗測定HI效價，效價大于1︰210的抗體經(jīng)檢驗合格后保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4 免疫復(fù)合物的制備

將經(jīng)1.2方法制備的滅活苗和經(jīng)1.3方法制備的抗體等體積混合，20 ℃孵育1 h。

1.5 免疫試驗

取45羽SPF雞，隨機分為3組。

第1組：注射生理鹽水0.2 mL/羽，作為陰性對照。第2組：注射NDV滅活苗0.2 mL/羽。第3組：注射免疫復(fù)合物疫苗0.2 mL/羽。接種后2周以相同劑量加強免疫1次。每隔1周隨機取雞只，測其血清HI效價。

1.6 攻毒試驗

取120羽SPF雞，隨機分為4組，前3組接種的劑量和方法同1.5。第4組：注射LaSota弱毒苗0.2 mL/羽。在免疫后4周攻毒，每組一半雞只注射106半數(shù)致死量（Lethal Dose 50%，LD50）的sh09 0.1 mL，另一半雞只注射106 LD50的F48E9 0.1 mL，比較各組的免疫保護率。

1.7 攻毒后RT-PCR檢測新城疫病毒

取攻毒后的雞腦組織樣本0.1 g，按Trizol-A+提取總RNA說明書提取RNA。根據(jù)NDV-NP基因序列，設(shè)計合成一對特異性引物用于NDV的檢測。引物序列如下：

NP-F： TAGAAGGTGTGAACCTCGAG

NP-R： CTTATGTATGAGTCTACATCC

PCR參數(shù)為：94 ℃預(yù)變性5 min，94 ℃變性30 s，53 ℃退火30 s，72 ℃延伸90 s，35個循環(huán)，最后72 ℃延伸10 min。

2 結(jié)果與分析

2.1 免疫試驗結(jié)果

通過測定血清HI效價，取各組的平均值，繪制的曲線表明，注射免疫復(fù)合物疫苗的雞體內(nèi)抗體HI效價上升較顯著，明顯高于只注射滅活疫苗組（圖1）。

2.2 攻毒試驗結(jié)果

對各組的抗體效價和存活率進行相互比較，從表1可以看出，LaSota疫苗組對sh09株感染沒有保護作用，免疫復(fù)合物疫苗可以很好地應(yīng)對sh09和F48E9的攻擊，而對照組的死亡率為100%。

2.3 RT-PCR檢測結(jié)果

利用病毒在雞體內(nèi)的繁殖情況測試NDV免疫復(fù)合物的效果。sh09株攻毒后3 d，用RT-PCR檢測病毒的數(shù)量，如圖2所示，免疫復(fù)合物疫苗組沒有檢測到病毒的存在。然而，在接種LaSota疫苗的雞中檢測到了NDV病毒。結(jié)果進一步證明了免疫復(fù)合物疫苗能很好地抑制病毒在雞體內(nèi)的繁殖。

3 討論

免疫復(fù)合物疫苗是抗原與抗體按照特定比例配置的新型疫苗。注射高免抗體屬于人工被動免疫。特異性抗體可以使機體立即獲得特異性免疫，它與主動產(chǎn)生的自動免疫不同，其特點是效應(yīng)快，不需經(jīng)過潛伏期，可立即獲得免疫力，但維持時間短[6]。傳統(tǒng)觀點認為抗體與抗原的免疫中和反應(yīng)將會降低疫苗的免疫效果及抗體效價，因此主動免疫與被動免疫在使用時往往是分開的，而不是同時聯(lián)合運用。本實驗將兩者是否能結(jié)合起來以及怎樣結(jié)合作為實驗?zāi)康模ㄟ^分組比較表明抗體能夠提高抗原的免疫效果，而且所獲的復(fù)合物疫苗免疫能很好地應(yīng)對強毒的攻擊。本文中用到的抗體是從雞蛋中提取的卵黃抗體IgY，它與傳統(tǒng)雞血清分離的抗體相比，獲取方便且所獲抗體的量大，便于推廣應(yīng)用。

參考文獻：

[1] 蔡寶祥.家畜傳染病學(xué)[M].4版.北京：中國農(nóng)業(yè)出版社，2001.

[2] 章振華，姜北宇，李永清，等.新城疫復(fù)合物疫苗對1日齡雛雞免疫效果的研究[J].中國畜牧獸醫(yī)，2009，36（3）：157-159.

[3] LIU H，WANG Z，WU Y，ZHENG D，et al.Molecular epidemiological analysis of Newcastle disease virus isolated in China in 2005[J].J Virol Methods，2007，140（1/2）：206-211.

[4] RANDALL R E，YOUNG D F.Humoral and cytotoxic T cell immune responses to internal and external structural proteins of simian virus 5 induced by immunization with solid matrix-antibody-antigen complexes[J].J Gen Virol，1988，69（Pt10）：2505-2516.

[5] 姚火春.獸醫(yī)微生物學(xué)實驗指導(dǎo)[M].2版.北京：中國農(nóng)業(yè)出版社，2001.

[6] 李公美，劉海軍，王海燕，等.抗原-抗體復(fù)合物疫苗研究進展[J].動物醫(yī)學(xué)進展，2010，31（7）：78-81.