國蘭組織培養研究進展

洪 霞，米 敏，劉也楠，陳銀龍

(臺州市農業科學研究院，浙江臺州 317000)

國蘭，又稱中國蘭，古代稱之蘭蕙，在我國具有悠久的栽培歷史。在古時，就有以“蘭章”喻詩文之美，以“蘭交”喻友誼之真，更有眾多詠蘭詩詞。國蘭屬于單子葉多年生蘭屬植物，為附生或地生草本，包括春蘭(C.goeringii)、蕙蘭(C.faberi)、建蘭(C.ensifolium)、墨蘭(C.sinense)、寒蘭(C.kanran)、蓮瓣蘭(C.tortisepalum)與春劍(C.tortisepalumvar.longibracteatum)等7種，除了春劍為蓮瓣蘭的變種外，其他均為原生種。國蘭的園藝品種非常豐富，多達上千種，以悠遠清新的香氣與獨特的花藝、型藝為國人所喜愛，具有較高的欣賞價值與經濟效益[1-2]。在自然環境下，野生的國蘭資源遭遇大量的采挖，已經很少能發現珍稀資源。已有的國蘭品種主要通過分株進行繁殖，栽培條件要求較高，繁殖力低，且對母株有一定的傷害，很多品種不能滿足市場的需求，有的甚至導致一苗難求的局面，阻礙國蘭市場的繁榮。組織培養是蘭花有效的繁殖方式，能獲取大量幼苗。1960年，首次使用大花蕙蘭莖尖進行組織培養，誘導出小球體[3]。部分國蘭自交或者雜交得到的種子進行萌發能獲取性狀分離、表型特征不同的新幼苗。利用組織培養，有些材料能夠突變產生葉藝、花藝、增強抗性等，既提高觀賞價值，又豐富國蘭資源。因此，國蘭的組織培養對于優良品種擴繁以及新品種選育意義重大。

1 外植體的選擇與處理

根據植物細胞全能性理論，國蘭的根、莖、葉、花、種子等器官都能利用組織培養形成完整植株。葉片與根取材廣泛，對母株傷害較小，作為外植體較為理想。1965年，Winber以蕙蘭幼葉為外植體獲得原球莖，首次證明葉片為外植體獲得大量植株的可能性。但是，之后利用國蘭成熟植株的葉片獲得再生植株未見成功報道。根尖存在分生組織，取材方便，但誘導出芽難度很大，目前對根尖的研究集中在外植體消毒試驗方面[4-5]。除根尖與葉外，種子、芽(葉芽、花芽等)都是較好的外植體來源。

1.1種子蘭花種子為蒴果，輕薄細小，胚發育不完全，種子數量眾多但發芽率低，在自然環境下的萌發需要真菌的侵染，兩者存在共生關系。Bernard開創了蘭花種子的組織培養非共生萌發，卡特利亞蘭與蕾麗亞蘭的雜交種子在人工培養基上成功萌發[6]。非共生萌發不需要借助真菌的侵染作用，在加糖的適宜培養基中，種子能夠萌發，目前在大部分的國蘭品種中獲得成功。有研究表明，培養基中添加真菌誘導子能夠促進種子的膨大，提高種子的萌發率。真菌誘導子是指對作用植株具有專一性的菌絲體及其代謝物的混合物，在培養基中添加的作用效果與濃度相關。藍舉民等[7]在蕙蘭、春蘭根部提取真菌制成混合的真菌誘導子，發現能使春蘭種子萌發率提升15%～30%。此外，在適宜的萌發培養基上，春蘭自交、雜交種子的萌發時間、萌發率與授粉時間相關，以花后2～5 d為宜[8]。

蒴果消毒劑以75%乙醇與0.1%HgCl2為常用，消毒方式多種，有采用75%乙醇進行表面擦拭或者短時(30 s)浸泡，然后用HgCl2浸泡滅菌，也有使用75%乙醇先進行表面消毒后再短時灼燒滅菌[7，9-11]。有研究表明，由于蘭花蒴果果皮較厚實，使用HgCl2浸泡20 min甚至更長時間對萌發影響不大，反而能更好地滅菌，降低污染率[12]。種子的萌發率、萌發時間與種子的種類、熟度、培養基以及預處理方式有關。低濃度氫氧化鈉或次氯酸鈉溶液浸泡以及低溫預處理后熟能使蘭花種子萌發時間縮短，并且提高萌發率[11，13]。此外，還有研究表明金嘴墨蘭的種子萌發以低無機鹽濃度的基本培養基更為合適[14]。

1.2莖尖與側芽早在20世紀60年代，洋蘭的莖尖組織培養以及工廠化生產已獲得成功。80—90年代，國內開展了大量國蘭莖尖與側芽的組織培養工作。其中，王熊等[15-16]利用莖尖與側芽，在建蘭、蕙蘭、春劍的多個園藝品種中獲得大量的無性系；賈勇炯等[17]也在建蘭中利用腋芽獲得無性系。2000年以來，黃萍萍等[18]利用素心蘭的新生芽獲得大量幼苗。利用莖尖與芽，項艷等[19]在墨蘭中獲得成功。近期，隨著組培技術的發展，馮兆光等[20]以春蘭“龍字”的側芽為外植體，建立快繁體系。外植體的誘導成功率與獲取部位有關，莖尖優于側芽，中上部的側芽優于基部。外植體大小一般為1～2 mm的芽，以帶有1～2個葉原基為好[21]。也有研究表明，以國蘭新芽為外植體，新芽以9～13 cm 長為好，啟動與誘導成功率最高[22]。但是，選取莖尖與新芽往往對母株造成一定的傷害，尤其是珍貴品種，外植體來源并不廣泛。用芽端誘導啟動雖然難度不大，但容易褐化，大部分在啟動后褐化死亡[22]。

莖尖與側芽的消毒處理主要分為2種，一是75%乙醇先浸泡15 s或者20 s，再轉入0.1% HgCl2浸泡10 min。二是使用10% NaClO浸泡10 min。與種子的消毒方式相比，由于莖尖與側芽較嫩且不像種子一樣有種皮包裹，消毒時間縮短。此外，也有研究認為，蕙蘭的莖尖先以75%乙醇處理30 s，再使用10% NaClO處理20 min的消毒效果較好[5]。

1.3花芽國蘭的花梗上帶有芽，也可以作為外植體的來源。人們最早利用蝴蝶蘭的花芽獲得快繁無性系。與洋蘭相比，國蘭的花器官誘導成功率不高。其中，賈勇炯等[23]利用MS培養基獲得彩心建蘭無性系；張志勝等[24]誘導出下山墨蘭原球莖，而仙殿白墨與企劍黑墨的花芽經過誘導未能啟動；曾宋君等[25]以MS為基礎培養基，添加活性炭與合適的激素，使仙殿白墨及其雜交種的花芽成功誘導并啟動。最近的研究表明，春劍的花梗切斷在誘導出愈傷過程中，褐化率與切斷的長度、厚度相關，大部分花梗切段在合適的激素配比下能夠轉綠膨大，但后續并沒有增殖分化的報道[26]。

花芽的選取長度一般在2～6 cm，在消毒滅菌前小心剝除外面的苞片，再按照常規消毒方法進行消毒即可[23]。另有研究先用洗滌液清洗帶土的花苞，再剝除苞片，每剝除幾片苞葉就用60%乙醇或者HgCl2消毒，防止污染[21]。

2 培養基

國蘭組織培養選用的基礎培養基與其他植物類似，如MS、KC、B5、Kyoto等。雜交春蘭的萌發以MS為好，增殖分化以WPM為好[27]。在中透藝春蘭的根狀莖增殖分化過程中，B5培養基雖然增殖快但長勢弱、易褐化，W培養基增殖慢，總體評價以3/4 MS為好[28]。仙殿白墨的種子萌發后，根狀莖的增殖以1/2 MS、MS培養基為好，B5、N6、Kundson C、V&W、White等培養基增殖效果不好；分化以1/2 MS培養基為好，B5培養基雖然出芽效果好，但是沒有根[25]。墨蘭(Cymbidiumsinense)×兔耳蘭(Cymbidiumlancifolium)種間雜種根狀莖芽分化也以1/2 MS培養基為好[29]。綜上所述，在最初開展試驗優先以MS或1/2 MS為基本培養基。

3 植物生長調節物質

3.1激素目前，使用的激素分為兩大類，細胞分裂素與生長素。細胞分裂素主要有6-BA、KT、TDZ等，生長素常用的有IBA、NAA、IAA、2，4-D等。張菊野等[30]、牛田等[31]研究表明，NAA利于春蘭原球莖的增殖與根的形成，而BA則利于芽的分化。但是，同樣在春蘭上，與張菊野的研究恰好相反，陳爾等[32]認為6-BA濃度的適當提高，NAA濃度的降低有利于春蘭根狀莖的增殖，可見，品種不同、來源不同的春蘭根狀莖增殖分化條件也會發生變化。邢海等[28]對中透藝春蘭根狀莖增殖分化研究表明，6-BA與TDZ都能促進增殖，但在相同濃度6-BA下，TDZ比NAA更能促進根狀莖的增殖。卜朝陽等[13]研究表明不同比例6-BA與NAA激素組合對蕙蘭根狀莖增殖影響較大，以組合4 mg/L 6-BA+1 mg/L NAA為最佳。賈勇炯等[17]對簇生建蘭花芽誘導進行研究，發現NAA在1～5 mg /L和BA 在0.5～3.0 mg /L的范圍內，提高激素的濃度有利于花芽誘導產生原球莖。從以上研究來看，不同品種的蘭花增殖分化需要的生長素與細胞分裂素的比例并不相同，但不論是增殖還是分化，激素的添加需要合適的濃度范圍[33]。

3.2有機物質馬鈴薯汁、蘋果汁、椰子汁、香蕉泥等有機物質的添加能夠促進蘭花種子的萌發，根狀莖增殖與分化。研究表明，添加20% 椰子汁促進小鳳蘭根狀莖的分化，添加60 g/L 土豆泥顯著促進試管苗生長[34]。謝利等[35]在雜交蘭生根培養中添加100 g/L馬鈴薯汁能促進幼芽生根壯苗。劉道敏等[36]在蕙蘭“綠蕙紅舌”種子的組織培養過程中，從萌發、增殖到分化以及最后的生根壯苗均以添加200 mg/L的馬鈴薯汁為好。但是，對于春蘭的根狀莖增殖來說，在獼猴桃汁、香蕉汁、梨汁、蘋果汁、白蘿卜汁、胡蘿卜汁、馬鈴薯汁、紅薯汁8 種有機物中，以獼猴桃汁的效果最佳，根狀莖中細胞分裂相關基因的表達顯著提高[37]。卜朝陽等[13]在種子萌發過程中添加10%椰子汁為好。施福軍等[14]在墨蘭的生根培養中認為添加100 g/L營養附加物，如香蕉泥、馬鈴薯汁、椰子汁、紅薯汁、玉米汁等均能促進生根壯苗。對建蘭“嶺南奇蝶”生根過程研究，添加香蕉與馬鈴薯的培養基對生根的效果要顯著優于添加椰子汁的培養基[12]。春蘭與大花蕙蘭雜交的后代添加椰子汁增殖效果最好，生根壯苗以添加馬鈴薯汁與香蕉泥為好[38]。在不同有機物質的添加過程中，一般使用的椰子汁濃度為10%，馬鈴薯汁、香蕉泥等則在50～100 g/L為常用。

3.3活性炭添加活性炭主要是利用活性炭的吸附作用，減少培養材料代謝過程中產生的有害物質，減輕褐化現象。不同濃度的活性炭對墨蘭地下根狀莖段誘導效果不同，以1.0 g/L為好[39]。陳蘭芬等[40]在墨蘭芽分化時認為添加的活性炭濃度以0.3 g/L為好。但在其他品種國蘭中有較多研究表明活性炭的添加對芽分化起到抑制作用，如小鳳蘭的研究表明活性炭添加促進苗的分化但抑制芽的分化；添加0.3 g/L活性炭能夠促進玉女蘭類的雜交蘭類原球莖增殖，而芽分化較少，不添加活性炭時則有大量芽分化[34]。劉映雯等[41]對蓮瓣蘭“滇梅” 根狀莖增殖分化的研究發現，添加0.5 g/L活性炭對增殖來說較為合適，而在分化時以不添加活性炭為好，認為有可能活性炭在吸附有害物質的同時也吸附了葉酸激素等一些活性物質。褚云霞等[42]發現活性炭的存在嚴重抑制春蘭根狀莖分化成芽，與上述活性炭添加抑制芽分化的研究結果具有一致性。此外，陳爾等[32]發現1.0～3.0 g/L的活性炭有利于春蘭根狀莖的增殖。在幼芽生根方面，不同品種的國蘭適宜活性炭濃度并不相同，“宋梅”“集圓”雜交蘭添加3.0 g/L活性炭時有利于生根[43]，而“環球荷鼎×九章梅”雜交種在活性炭濃度為1.0 g/L時，組培苗平均新根數與新根長數最大[44]。

4 培養方式與條件

國蘭的組織培養可以采用固體或者液體培養基，大部分采用固體培養基培養。有研究用液體培養基以彩心建蘭莖尖為外植體誘導獲得無性系[45]；也有研究認為液體培養基更有利于國蘭種子的萌發，萌發早且整齊度高[46]。與大部分植物組培條件相似，培養溫度為(25±2)℃，光照強度為2 000～2 500 lx。對中透藝春蘭的研究發現，當光照為1 000 lx或者3 000 lx時，不利于其分化時保持藝向穩定，以2 000 lx左右為好[27]。不同的光源對春蘭與大花蕙蘭雜交后代組培苗生長影響不同，墨蘭×大花蕙蘭F1代生長以LED紅藍復合光(2RB)為好[47]。根據研究的材料與目的的不同，光照時間有8、12、14 h/d不等。蘭花喜酸，在組織培養時pH一般在5.4左右，根據品種的不同在5.0～6.0變化。

5 展望

我國蘭花資源豐富，國蘭深受人們喜愛。不管是野外采集還是對傳統品種的分株繁殖，都不能滿足市場需求，導致價高甚至一苗難求。組織培養擴大繁殖是保存稀有品種以及推進國蘭商品化的重要手段。目前，通過組織培養也有部分國蘭品種實現商品化，市場上能見到的組培苗品種有隆昌素、宋梅、大富貴、環荷等[48]。但是，目前很多品種由于存在技術上的原因難以實現大量組培擴繁。此外，大花蕙蘭花大色艷，經濟效益好，可與國蘭進行雜交獲得雜交種質，改造國蘭創制新品種，但雜交種質的萌發與成苗必須以組織培養技術來支撐。因此，通過對不同來源外植體實現組織培養技術突破，將對國蘭市場的良性發展起到助力作用。