Hedgehog通路抑制劑HhAntag的合成

顧壽勝

（1.江南大學(xué)藥學(xué)院,江蘇 無(wú)錫214122;2.潤(rùn)澤制藥（蘇州）有限公司,江蘇 蘇州 215126）

Hedgehog通路抑制劑HhAntag的合成

顧壽勝1,2

（1.江南大學(xué)藥學(xué)院,江蘇 無(wú)錫214122;2.潤(rùn)澤制藥（蘇州）有限公司,江蘇 蘇州 215126）

在許多人體組織中，Hedgehog (Hh)信號(hào)通路的配體依賴(lài)性激活與腫瘤發(fā)生相關(guān)聯(lián)，具有抗腫瘤活性，而HhAntag是GLi1介導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄抑制劑，是一種Hedgehog信號(hào)通路拮抗劑。本文介紹了以5-氯-2-硝基苯胺為原料通過(guò)四步反應(yīng)合成Hedgehog通路抑制劑HhAntag（N-[4-氯-3-[5-(二甲基氨基)-1H-苯并咪唑-2-基]苯基]-3,5-二甲氧基苯甲酰胺）。

Hh信號(hào)通路抑制劑；N-[4-氯-3-[5-(二甲基氨基)-1H-苯并咪唑-2-基]苯基]-3,5-二甲氧基苯甲酰胺；合成

Hedgehog（Hh）信號(hào)通路主要由配體 Sonic hedgehog ( Shh)、膜受體Patched (Ptch )、信號(hào)開(kāi)關(guān)蛋白Smoothened(Smo )及下游的轉(zhuǎn)錄因子Gli 組成。國(guó)內(nèi)已有報(bào)道的Hh信號(hào)通路的抑制劑有以Smo為靶點(diǎn)的小分子抑制劑：環(huán)杷明 (cyclopamine )及vismodegib(GDC-0449)，在抑制Hh通路的活性方面，已證實(shí)HhAntag比cyclopamine強(qiáng)效約10倍。觀察到對(duì)HhAntag一定范圍的細(xì)胞敏感性，作用于生長(zhǎng)抑制的IC50值范圍是2μM到30μM。鑒于Hh信號(hào)在多種腫瘤適應(yīng)癥的治療中存在著較大的潛力,因此開(kāi)發(fā)全新結(jié)構(gòu)的Hh抑制劑具有重要臨床意義[1～7]。Hhantag 化 學(xué) 名 稱(chēng) 為 N-(4-chloro-3-(5-(dimethylamino)-1H-benzo[d]imidazol-2-yl)phenyl)-3,5-dimethoxybenzamide， 分 子 式24H23ClN4O3， 相對(duì)分子質(zhì)量450.92，CAS登記號(hào)為496794-70-8?；瘜W(xué)結(jié)構(gòu)式見(jiàn)圖1。

而在專(zhuān)利[10]文章中提及圖3合成路線(xiàn)以鄰苯二胺為原料與2-甲基-5-硝基苯甲酸在多聚磷酸條件下高溫反應(yīng)環(huán)合得到2-（2-甲基-5-硝基苯）-1H苯并咪唑化合物，再以甲苯、醋酸條件中125度反應(yīng)1hr進(jìn)行硝基還原反應(yīng)，最后進(jìn)行酰胺反應(yīng)鏈接R3基團(tuán)。

在專(zhuān)利文章[8][11]中提到化合物中間體3的合成路線(xiàn)如圖2所示：以2-硝基苯胺為原料溶于乙腈中，滴入2-氯-5-硝基苯甲酰氯的乙腈溶液，反應(yīng)在N2保護(hù)下控制滴加時(shí)反應(yīng)溫度在25度以?xún)?nèi)，滴完后升溫至75度反應(yīng)1hr。反應(yīng)降溫至0度過(guò)濾，產(chǎn)品用冷乙腈洗滌得到淡黃色產(chǎn)品，收率50%。將化合物2溶于乙醇并升溫至40度，分三批將氯化亞錫和鹽酸投入反應(yīng)中，逐步將反應(yīng)溫度升至80度并攪拌反應(yīng)2h。將反應(yīng)降至0度后滴入1N的氫氧化鈉溶液將PH調(diào)12-13，反應(yīng)不超過(guò)10度，反應(yīng)液用水稀釋后乙酸乙酯萃取，有機(jī)層合并后洗滌干燥旋干得到粗品，二氯甲烷/甲醇（60：1）柱層析得到中間體3-(1H-苯并咪唑-2-基)-4-氯-苯胺，收率68%。

專(zhuān)利[10]文章中相似結(jié)構(gòu)中間體的合成路線(xiàn)如圖4：以鄰硝基苯胺為原料與2-氯-5-硝基苯甲酰氯在二氯甲烷體系中進(jìn)行酰胺反應(yīng)，接著以鐵粉為還原劑在乙酸體系中還原并和環(huán)，再進(jìn)行酰胺反應(yīng)鏈接R3基團(tuán)。

此專(zhuān)利也提及另一種以對(duì)氰基鄰苯二胺為原料與2-甲基-5-硝基苯甲酸在醋酸條件中反應(yīng)獲得中間體過(guò)渡態(tài)再經(jīng)升溫環(huán)合生成2-(2-氯-5-硝基苯基)-5-氰基苯并咪唑化合物如圖5；

專(zhuān)利[9]文章中相似結(jié)構(gòu)中間體的合成路線(xiàn)如圖6：

此專(zhuān)利[9]所涉及的合成路線(xiàn)與專(zhuān)利[10]中路線(xiàn)圖4相似，以鄰硝基苯胺結(jié)構(gòu)的原料與2-氯-5-硝基苯甲酰氯在二氯甲烷體系中進(jìn)行酰胺反應(yīng)，接著以鋅粉為還原劑在乙酸體系中還原兩個(gè)硝基并關(guān)環(huán)生成關(guān)鍵中間體。

而HHantag結(jié)構(gòu)中二個(gè)甲基的形成可參考圖7第一種合成方法：以5-氯-2-硝基苯胺為原料在乙醇體系中與二甲胺反應(yīng)生成5-二甲基氨基-2-硝基苯胺，具體事例如下：

將5-氯-2-硝基苯胺(4.14 g, 24.0 mmol) 溶于乙醇 (62 ml)中，倒入密封反應(yīng)管中,加入 40%二甲胺溶液(22.5 ml, 178 mmol, 7.4 eq)，在90°C 油浴中反應(yīng)2天. 降溫后補(bǔ)充40%二甲胺溶液 (7.5 ml)繼續(xù)加熱反應(yīng)3天. 反應(yīng)降至室溫后，將反應(yīng)液倒入(250 ml)冰水中.攪拌后過(guò)濾，濾餅用水(200 ml)洗滌，減壓干燥得到黃色產(chǎn)品5-二甲基氨基-2-硝基苯胺4.16g，收率96%。

第二種合成方法參考專(zhuān)利[9]如圖8：酰胺反應(yīng)，再進(jìn)行還原環(huán)合反應(yīng)就可以得到中間體2-(5-氨基-2-氯苯基)-5-(N,N-二甲基氨基)-1H-苯并咪唑，再與3,5-二甲氧基苯甲酰氯進(jìn)行酰胺反應(yīng)合成得到終產(chǎn)品Hhantag。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 主要試劑與儀器

2-硝基-5-氯苯胺，2-氯-5-硝基苯甲酸，3,5-二甲氧基苯甲酸，N,N-二甲基甲酰胺，碳酸鉀，氯化亞錫，乙醇，二甲胺水溶液，乙腈；核磁氫譜（1H NMR）：Bruker 400、液質(zhì)聯(lián)用儀：Agilent 1100、真空干燥箱、旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀、循環(huán)水多用真空泵等。

1.2 化合物的合成

將5-氯-2-硝基苯胺(50 g，0.29 mol)溶于乙醇(1.1 L) 投入5L密封反應(yīng)瓶中，在0-50C快速投入二甲胺鹽酸鹽(130 g，1.59 mmol) 和三乙胺(260 ml)。反應(yīng)加熱至130oC 壓力4bar攪拌20hr. 反應(yīng)結(jié)束后降溫減壓旋除乙醇，殘余溶液滴入2 M 氫氧化鈉溶液(1 L) 調(diào)PH至堿性，用EA多次萃取，合并有機(jī)相后飽和氯化鈉洗滌干燥，過(guò)濾濾液減壓旋蒸得到產(chǎn)品5-二甲基氨基-2-硝基苯胺，收率95%。比較上述兩種甲基化的方法收率相近，原料相似但都需要密封體系帶壓進(jìn)行反應(yīng)，不適合工藝化。后經(jīng)過(guò)優(yōu)化在常壓回流狀態(tài)下改變二甲胺的投料比亦可使反應(yīng)完全。

綜合上述研究資料并通過(guò)合成摸索試驗(yàn)，化合物Hhantag的合成設(shè)計(jì)路線(xiàn)如圖9所示由5-氯-2硝基苯胺為原料先進(jìn)行甲基化反應(yīng)、

Step 1： 在10L三口反應(yīng)瓶中加入DMF（6.5L），機(jī)械攪拌下加入碳酸鉀（1412g 10.2mol）和原料5-氯-2-硝基苯胺（800g 4.65mol），先加入二甲胺水溶液500ml后升溫至回流，控制反應(yīng)溫度在100度以上，滴加二甲胺水溶液2000ml。取樣檢測(cè)，如仍有原料未反應(yīng)繼續(xù)補(bǔ)加二甲胺水溶液至反應(yīng)結(jié)束。降溫，將溶液倒入冰水中，析出產(chǎn)品，過(guò)濾，用水多次洗滌濾餅，烘干得到800g產(chǎn)品，收率95%。MS(ESI)(m/z):[M+H]181.19 1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 3.04 (s, 6H), 5.76(d, 1H), 6.12(dd, J = 2.7, 9.8 Hz, 1H), 7.99 (d, J = 9.8 Hz, 1H)。

Step 2： 在10L三口反應(yīng)瓶中加入5-二甲基氨基-2-硝基苯胺（800g 4.42mol）和ACN溶液6L，室溫?cái)嚢柘碌渭?-氯-5-硝基苯甲酰氯（1065g 4.85mol）的ACN（2L）溶液，滴加完成后升溫至80度，反應(yīng)2hr出現(xiàn)大量固體，中控?zé)o原料后冷卻，過(guò)濾漂洗，烘干得1.4kg產(chǎn)品，收率87%。MS(ESI)(m/z):[M+H]364.74

Step 3： 在10L三口反應(yīng)瓶中加入原料2-氯-N-（5-（二甲氨基）-2-硝基苯基）-5-硝基苯胺（900g 2.47mol）和乙醇9L攪拌下升溫至60度，分批加入SnCl2，將反應(yīng)溫度逐步升至80度，攪拌過(guò)夜，檢測(cè)無(wú)原料后降溫。置換入大桶中，攪拌下滴加10%的氫氧化鈉溶液，控制反應(yīng)溫度10度以下，調(diào)PH值至12～13，用EA萃取5次（5L*5）其間補(bǔ)加10%氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié)PH。合并有機(jī)相，用稀氫氧化鈉溶液和飽和食鹽水洗滌后無(wú)水硫酸鈉干燥，濃縮過(guò)濾得到產(chǎn)品460g，收率65%。MS(ESI) (m/z):[M+H]286.76。

Step 4： 在10L三口反應(yīng)瓶中加入2-（5-氨基-2-氯苯基）-5-(N，N-二甲基氨基)-1H-苯并咪唑（800g 2.8mol）和5L CH2Cl2溶液，室溫?cái)嚢柘碌渭?,5-二甲氧基苯甲酰氯（740g 3.36mol）的CH2Cl2溶液，滴完攪拌過(guò)夜。中控分析無(wú)原料后過(guò)濾，濾餅用CH2Cl2洗滌，得產(chǎn)品N-[4-氯-3-[5-(二甲基氨基)-1H-苯并咪唑-2-基]苯基]-3,5-二甲氧基苯甲酰胺1.3kg，收率96%,HPLC 95%。MS(ESI)(m/z): [M+H]450.92;1HNMR(400MHz,CDCl3)8.426 (s, 1H), 8.316 (m, 1H), 8.221 (m, 1H), 7.46(s, 1H), 7.546(m, 1H), 7.419 (m, 1H), 7.031 (m, 2H), 6.885 (m, 2H), 6.610 (m,1H), 3.840 (s, 6H), 2.993 (s, 6H)。

中間原料2-氯-5-硝基苯甲酰氯以2-氯-5-硝基苯甲酸為原料與氯化亞砜回流反應(yīng)完成后旋除多余氯化亞砜得到所需的對(duì)應(yīng)酰氯，再與4-氨基-N,N-二甲基-3-硝基苯胺進(jìn)行下一步酰胺化反應(yīng)。而3,5-二甲氧基苯甲酰氯以3,5-二甲氧基苯甲酸為原料與氯化亞砜回流反應(yīng)完成后旋除多余的氯化亞砜得獲得所需的3,5-二甲氧基苯甲酰氯；再與環(huán)化中間體2-（5-氨基-2-氯苯基）-5-(N，N-二甲基氨基)-1H-苯并咪唑進(jìn)行酰胺反應(yīng)得到終產(chǎn)品并進(jìn)行結(jié)晶純化。

2 結(jié)語(yǔ)

整個(gè)合成設(shè)計(jì)路線(xiàn)以5-氯-2-硝基苯胺原料經(jīng)過(guò)第一步常壓甲基化反應(yīng)、第二步酰胺反應(yīng)、第三步還原環(huán)合反應(yīng)、第四步酰胺反應(yīng)后合成獲得終產(chǎn)品HhAntag。通過(guò)對(duì)原有參考文獻(xiàn)工藝進(jìn)行改進(jìn)優(yōu)化，簡(jiǎn)化了合成路線(xiàn)從原料經(jīng)過(guò)四步反應(yīng)即可合成N-[4-氯-3-[5-(二甲基氨基)-1H-苯并咪唑-2-基]苯基]-3,5-二甲氧基苯甲酰胺，此方法經(jīng)優(yōu)化后適合在實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行放大，且并未采用三廢較多的鐵粉還原，不需要使用高壓設(shè)備可生產(chǎn)獲得公斤級(jí)產(chǎn)品，為工業(yè)化生產(chǎn)打下了基礎(chǔ)。

[1]張連第,辛敏行,文珺等.4-(嘧啶-2-氨基)苯甲酰胺衍生物的設(shè)計(jì)、合成及 Hedgehog信號(hào)通路抑制研究[J].有機(jī)化學(xué),2014(34):1407-1416

[2]武玉杰,李京敏,王東.Hedgehog信號(hào)通路與腫瘤[J].濱州醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào),2010(03):201-203

[3]李艷陽(yáng),趙硯瑾,李庶心.Hedgehog通路抑制劑vismodegib的合成[J].中國(guó)新藥雜志,2013(17):2090-2092

[4]HhAntag,a Hedgehog Signaling Antagonist, Suppresses Chond-rogenesis and Modulates Canonical and Non-Canonical BMP Signaling.

[5]Jillian L,Brechbiel,Jessica M.Y.NG and Tom Curran PTHrP Treatment Fails to Rescue Bone Defects Caused by Hedgehog Pathway Inhibition in Young Mice.

[6]Yandong Shi,Ubiratan Moura,Isabelle Opitz,Alex Soltermann,Hubert Rehrauer,Svenja Thies,Walter Weder, Rolf A.Stahel1,and Emanuela Felley-Bosco Role of Hedgehog Signaling in Malignant Pleural Mesothelioma.

[7]Dongsheng gu, Kelly E Schlotman, Jingwu Xie Deciphering the role of hedgehog signaling in pancreatic cancer pressure[8]Hedgehog antagonists having zinc binding moieties，US2014018368A1。

[9]Mediators of Hedgehog Signaling Pathways, Compositions and Uses Related Thereto，WO2006050506A1.

[10] Mediators of Hedgehog Signaling Pathways,Compositions and Uses Related Thereto,WO03011219A2.

[11]Hedgehog antagonists having zinc binding moieties,WO2012094328A2.

10.16640/j.cnki.37-1222/t.2018.01.105