蒼菊清肝降脂方對蛋氨酸-膽堿缺乏誘導(dǎo)小鼠脂肪性肝炎的防護(hù)作用*

明利平 平鍵 成揚(yáng),△ 胡曉鳳 周向杰 蔡顧慶

1.上海浦東新區(qū)傳染病醫(yī)院 (上海， 201299) 2.上海中醫(yī)藥大學(xué)附屬曙光醫(yī)院

蒼菊清肝降脂方對蛋氨酸-膽堿缺乏誘導(dǎo)小鼠脂肪性肝炎的防護(hù)作用*

明利平1平鍵2成揚(yáng)1,2△胡曉鳳1周向杰1蔡顧慶1

1.上海浦東新區(qū)傳染病醫(yī)院 (上海， 201299) 2.上海中醫(yī)藥大學(xué)附屬曙光醫(yī)院

目的：觀察蒼菊清肝降脂方對蛋氨酸-膽堿缺乏(MCD)誘導(dǎo)的小鼠脂肪性肝炎的防護(hù)作用。方法C57BL/6小鼠60只，雌雄各半，隨機(jī)分為對照組、模型組、蒼菊清肝降脂方(蒼菊方)高中低劑量組和多稀磷脂酰膽堿組，對照組小鼠給予蛋氨酸-膽堿充足(MCS)飼料，其他各組小鼠予MCD飼料，自由進(jìn)食。對照組和模型組灌胃飲用水，其余各組分別灌胃相應(yīng)治療藥物。2w末，采集小鼠血清、肝組織標(biāo)本，檢測血清丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(ALT)、天冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(AST)、肝組織甘油三酯(TG)含量，觀察肝組織HE染色及油紅O染色。結(jié)果與對照組小鼠比較，模型組小鼠ALT、AST、TG水平顯著升高，經(jīng)蒼菊方干預(yù)的各組小鼠ALT、AST、TG水平均顯著下降，且呈劑量依賴方式，其中高劑量蒼菊方治療療效與多烯磷脂酰堿療效組相近。模型組小鼠肝組織HE染色可見大量大泡性脂肪，肝細(xì)胞呈氣球樣變，油紅O染色可見大量大小不等紅色脂滴，部分融合成片，經(jīng)用藥干預(yù)，各組小鼠肝組織脂肪變性和肝臟炎癥均明顯改善。結(jié)論蒼菊清肝降脂方可明顯改善MCD飲食誘導(dǎo)的脂肪性肝炎肝損傷程度。

蒼菊清肝降脂方；非酒精性脂肪性肝炎；小鼠；防護(hù)作用

蒼菊清肝降脂方是上海市浦東新區(qū)傳染病醫(yī)院用于脂肪肝治療的協(xié)定復(fù)方，前期研究已證實(shí)，該方對四氯化碳誘導(dǎo)的脂肪肝具有良好的干預(yù)作用[1,2]，本研究采用蛋氨酸-膽堿缺乏(MCD)飼料誘導(dǎo)小鼠脂肪性肝炎，觀察該方的干預(yù)作用，為臨床應(yīng)用進(jìn)一步提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1.材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動物 C57BL/6小鼠60只，雌雄各半，19±0.74g，購自上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動物有限公司，飼養(yǎng)于上海中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心。

1.2 飼料 蛋氨酸-膽堿缺乏(MCD)飼料(配方：L-氨基酸176 g/kg、蔗糖442 g/kg、玉蜀黍淀粉150g/kg、右旋麥芽糖50g/kg、纖維素30g/kg、玉米油l00g/kg、碳酸氫鈉7.4g/kg、鹽混合物35g/kg、維生素混合物l0g/kg)和蛋氨酸-膽堿充足(MCS)飼料(配方是在MCD飲食配方基礎(chǔ)上加膽堿2g/kg)由江蘇南通特洛菲有限公司提供，4℃低溫保存。

1.3 藥物 ①蒼菊清肝降脂方(簡稱蒼菊方)，由蒼術(shù)、炒白術(shù)、荷葉、決明子、菊花、蒲黃、五味子等組成，均采用江陰天江藥業(yè)有限公司中藥免煎顆粒，按原方比例溶解備用。②對照藥物為多烯磷脂酰膽堿膠囊(賽諾菲安萬特北京制藥有限公司)。1.4 其他試劑及主要設(shè)備 二甲苯、甲醛、無水乙醇，為分析純；中性樹膠，均購自中國醫(yī)藥集團(tuán)上海化學(xué)試劑公司。蘇木素伊紅染料，油紅O染液，血清ALT、AST，肝組織TG檢測試劑盒，均購自南京建成生物制品研究所。輪轉(zhuǎn)切片機(jī)(RM2035)、冰凍切片機(jī)(CM1850)、烤片機(jī)、自動脫水機(jī)(LEICAASP300)、石蠟包埋機(jī)(LEICA EG1160)，均為德國Leica公司產(chǎn)品。光學(xué)顯微鏡(Olympus BX40)，日本Olympus公司。連續(xù)波長酶標(biāo)儀酶標(biāo)儀，美國BIO-TEK公司。

1.5 分組及給藥 小鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)5天后，按完全隨機(jī)方法隨機(jī)分為6組，對照組、模型組、蒼菊方高、中、低劑量組及多烯磷脂酰膽堿組，每組10只，雌雄各半。對照組小鼠喂飼MCS飼料模型及用藥各組喂飼MCD飼料，共2周。造模同時，蒼菊方高、中、低劑量組小鼠分別灌胃人體劑量，18、9、4.5倍蒼菊方藥液，多烯磷脂酰膽堿組小鼠灌胃按照人體劑量9倍灌胃，對照組和模型組小鼠灌胃等量雙蒸水。

1.6 標(biāo)本收集及指標(biāo)檢測 2w末，小鼠禁食12h后，稱體重、麻醉、摘眼球取血，取血后靜置2h，4℃，4000rpm，離心10 min，取上層血清備用。肝臟稱取重量后，取右葉0.5cm×0.5cm大小組織兩塊，于10%中性甲醛溶液中固定備用甲醛固定的肝組織于24h后逐級酒精脫水，二甲苯透明，石蠟包埋，4μm切片，經(jīng)脫蠟、脫水后行HE 染色，冰凍肝組織，7μm切片，行油紅O染色。血清ALT、AST水平、肝組織TG含量，參照試劑盒說明書進(jìn)行。

2.結(jié)果

2.1 各組小鼠體質(zhì)量及肝指數(shù)情況 見表1。

表1 各組小鼠體質(zhì)量及肝指數(shù)比較

2.2 各組小鼠血清ALT、AST及肝組織TG檢測情況 見表2。

表2 各組小鼠血清ALT、AST及肝組織TG含量

與對照組比較，*P<0.01；與模型組比較，#P<0.05

2.3 小鼠肝臟病理形態(tài)學(xué)觀察情況 肝組織HE染色觀察可見：模型組小鼠肝臟組織可見廣泛的大泡性脂肪變性，肝細(xì)胞可見氣球樣變，伴炎性細(xì)胞浸潤；蒼菊方用藥各組小鼠肝臟組織脂肪變性主要成小泡狀，肝細(xì)胞氣球樣變減輕；多烯磷脂酰膽堿組小鼠肝組織病理明顯改善(見插頁圖1)。

油紅染色，可見：對照組有少量油紅著色；模型組小鼠肝組織可見大量大小不等的紅色脂滴，部分有融合成片；藥物干預(yù)組紅色脂滴減小減少，其中多烯磷脂酰膽堿組小鼠肝組織改善最為明顯(見插頁圖2)。

3.討論

非酒精性脂肪性肝病(NAFLD)在全球范圍都是一種發(fā)病率較高的疾病，肥胖、2型糖尿病、高脂血癥均是NAFLD的主要危險因素。非酒精性脂肪性肝炎(NASH)是在NAFLD基礎(chǔ)上演變而來，其特征是在沒有過量飲酒的情況下，以肝實(shí)質(zhì)細(xì)胞脂肪變性以及脂肪堆積為特征，伴隨彌漫性肝小葉輕度炎癥，甚至在肝中央靜脈、肝竇間隙發(fā)生膠原沉積的臨床綜合征[3]。據(jù)文獻(xiàn)報道，約15%～20%的NASH患者可以在10～20年內(nèi)可進(jìn)展為肝硬化[4]，隨著乙肝疫苗的廣泛應(yīng)用以及抗病毒藥的發(fā)展，慢性病毒性肝炎引起的肝纖維化將逐步減少，NAFLD在未來可能成為慢性肝病的重要原因，有必要引起足夠的重視。NASH的發(fā)病機(jī)制較為復(fù)雜，除了其遺傳易感性與多元代謝紊亂的相互作用的主要因素外，還與胰島素抵抗、氧應(yīng)激及脂質(zhì)過氧化損傷、炎癥細(xì)胞因子、線粒體功能障礙、細(xì)胞凋亡及自噬等等諸多因素相關(guān)[5]。

NASH是肝內(nèi)以甘油三酯為主的脂肪蓄積過多為特點(diǎn)，實(shí)驗(yàn)研究中為了使動物模型肝臟達(dá)到這一病理特點(diǎn)，目前國內(nèi)外研究人員廣泛采用的方法包括高脂飲食、四氯化碳、MCD等。不同的造模方法各有特點(diǎn)，其中高脂飲食誘導(dǎo)的脂肪肝是通過飲食過量的脂質(zhì)，最終導(dǎo)致脂肪在肝臟的過度堆積，該模型可模擬人類的發(fā)病過程及機(jī)制，能夠復(fù)制胰島素抵抗、氧化應(yīng)激等人類全身代謝紊亂表現(xiàn)，在NASH研究領(lǐng)域更占優(yōu)勢，但是實(shí)驗(yàn)周期較長，而且動物進(jìn)食量較難控制，對造模時間有一定影響[6]。MCD飲食誘導(dǎo)的脂肪肝的原理在于蛋氨酸與膽堿的缺乏誘發(fā)線粒體β-氧化功能障礙和極低密度脂蛋白合成分泌減少，從而導(dǎo)致甘油三酯在肝臟的過度堆積，進(jìn)而肝細(xì)胞脂肪變性，最終誘發(fā)NASH，盡管該模型不符合患者的飲食結(jié)構(gòu)，但是其造模時間短，成模率高，組織病理學(xué)改變典型，是公認(rèn)的NASH造模方法[6，7]。因此本研究采用MCD方法，2w即可見肝組織明顯的脂肪變性，肝細(xì)胞氣球樣變，血清轉(zhuǎn)氨酶水平和肝組織TG含量均顯著升高，符合該模型特點(diǎn)。

根據(jù)脂肪肝的臨床表現(xiàn)，祖國醫(yī)學(xué)主要將其歸屬為“肝癖”、“肥氣”、“脅痛”等病名，病位在肝、脾、腎，發(fā)病機(jī)制為肝失疏泄，脾失健運(yùn)，濕熱內(nèi)蘊(yùn)，痰濁內(nèi)結(jié)，瘀血阻滯，而最終形成痰瘀互結(jié)，痹阻于肝臟脈絡(luò)而發(fā)病，治療上多辨病與辯證相結(jié)合[8]。蒼菊清肝降脂方是本單位在長期臨床實(shí)踐中不斷摸索總結(jié)用于治療脂肪性肝病的協(xié)定方，方中蒼白術(shù)可燥濕健脾、扶正固本；決明子潤腸通便、降脂；菊花清熱平肝明目；荷葉、蒲黃散瘀祛濕；五味子收斂固澀。全方有散有收，共奏疏肝理氣，健脾消脂之功。前期研究顯示該方可以有效減輕四氯化碳聯(lián)合高脂低蛋白飲食誘導(dǎo)的大鼠脂肪肝模型肝組織損傷和脂肪變性，減輕肝臟脂肪沉積，并顯著改善氧化應(yīng)激和脂質(zhì)過氧化[1,2]，為了進(jìn)一步驗(yàn)證該方防治脂肪肝作用，本文采用MCD誘導(dǎo)NASH小鼠模型，發(fā)現(xiàn)該方可明顯降低血清ALT、AST水平，減少肝組織TG含量，改善肝組織病理脂肪變性和脂肪堆積，且呈現(xiàn)劑量依賴性，其中高劑量蒼菊方療效與多烯磷脂酰膽堿相近，提示該方可有效治療MCD脂肪性肝炎，為該復(fù)方的臨床應(yīng)用提供了又一個實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

[1] 侯天祿, 成揚(yáng), 陳建杰. 蒼菊清肝降脂方對大鼠脂肪肝保護(hù)作用的研究[J]. 中國中西醫(yī)結(jié)合消化雜志. 2015， 23(7): 449-452.

[2] 龔亞華, 張銀華, 成揚(yáng), 等. 蒼菊清肝降脂方對脂肪肝大鼠肝組織脂肪沉積、氧化應(yīng)激和脂質(zhì)過氧化的影響[J]. 中國中西醫(yī)結(jié)合消化雜志. 2016， 24(08): 578-581.

[3] Hubscher SG. Histological assessment of non-alcoholic fatty liver disease[J]. Histopathology, 2006， 49(5): 450-465.

[4] Greenfield V, Cheung O, Sanyal AJ. Recent advances in nonalcholic fatty liver disease[J]. Curr Opin Gastroenterol, 2008， 24(3): 320-327.

[5] 黃穎秋. 非酒精性脂肪性肝炎發(fā)病機(jī)制的研究進(jìn)展[J]. 世界華人消化雜志, 2009， 17(31): 3181-3188.

[6] 續(xù)暢, 劉澤洲, 許可嘉, 等. 高脂及MCD飲食誘導(dǎo)非酒精性脂肪性肝炎動物模型的比較[J]. 現(xiàn)代生物醫(yī)學(xué)進(jìn)展， 2014， 14(18): 3451-3455.

[7] Gyamfi MA, Damjanov I, French S,etal. The pathogenesis of ethanol versus methionine and choline deficient diet-induced liver injury[J]. Biochem Pharmacol， 2008， 75(4): 981-995.

[8] 牛逍遙, 趙文霞. 非酒精性脂肪性肝病中醫(yī)研究進(jìn)展[J]. 中醫(yī)研究， 2016， 29(1): 75-78.

ProtectiveeffectofCangjuQingganJiangzhidecoctiononnonalcoholicsteatohepatitisinducedbymethioninecholinedeficientdietinmice

MINGLi-ping1,PINGJian2,CHENGYang1,2,etal.1.ShanghaiInfectiousDiseaseHospitalofPudongDistrict(Shanghai, 201299)China

ObjectiveTo observe the protective effect of Cangju qinggan jiangzhi decoction on nonalcoholic steatohepatitis induced by methionine choline deficient (MCD) diet in mice.MethodsSixty C57BL-6 mice, male and female, were randomly divided into control group, model group, Cangju qinggan jiangzhi deccoction groups (high and low dose group) and Essentiale group. the control group were given sufficient methionine choline (MCS) diet, other groups were given MCD diet, free food. At the same time, the control group and the model group were given water,other groups were given corresponding drugs respectively . At the end of 2 week, blood were collected through eyeball enucleation and mice were killed by cervical dislocation. Serum alanine aminotransferase (ALT) , aspartate aminotransferase (AST) and hepatic triglyceride (TG) content in liver tissue were detected and pathological changes were observed by HE staining and oil red O staining.ResultsCompared with the control group, ALT, AST, TG in the model group increased significantly.And Cangju qinggan jiangzhi decoction intervention groups were significantly decreased in a dose-dependent manner, Essentiale group improved the best effect. The model group HE staining of liver tissue mass bullous fat, liver cells showed ballooning, oil red O staining showed red lipid droplet sizes, some confluence, drug intervention group, hepatic steatosis and inflammation of the liver were significantly improved.ConclusionCangju qinggan jiangzhi decoction can significantly improve the degree of fatty hepatitis and liver injury induced by the MCD diet.

Cangjuqinggan jiangzhi decoction； nonalcoholic stepatohepatitis； mice, protective effect

10.3969/j.issn.1005-0264.2017.04.0014

上海市浦東新區(qū)科技發(fā)展基金創(chuàng)新資金醫(yī)療衛(wèi)士項(xiàng)目(No.PKJ2015-Y20)，上海市浦東新區(qū)衛(wèi)生系統(tǒng)領(lǐng)先人才項(xiàng)目 (No.PWRL2016-01)；△通訊作者

2017-3-31 編輯：肖明中)