扶正活血解毒方干預ANE誘導口腔黏膜成纖維細胞I型膠原表達的實驗研究

羅玉姣，岳金寶，吳 丹，劉 尋,李 群，譚 勁

(湖南中醫藥大學第一附屬醫院，湖南 長沙 410007)

扶正活血解毒方干預ANE誘導口腔黏膜成纖維細胞I型膠原表達的實驗研究

羅玉姣，岳金寶，吳 丹，劉 尋,李 群，譚 勁*

(湖南中醫藥大學第一附屬醫院，湖南 長沙 410007)

目的觀察檳榔提取液（areca nut extract，ANE）對口腔黏膜成纖維細胞I型膠原分泌的誘導作用及扶正活血解毒方的干預作用。方法體外培養口腔黏膜成纖維細胞，ANE為誘導劑，扶正活血解毒中藥藥物血清（低、中、高）為干預物；用免疫細胞化學法檢測細胞內I型膠原的表達，用酶聯免疫吸附劑測定法(ELISA)檢測培養上清I型膠原的含量。結果ANE對口腔黏膜成纖維細胞 I型膠原的合成有促進作用（P＜0.01），扶正活血解毒方含藥血清（中、高）對ANE刺激下的FB膠原合成有抑制作用（P＜0.05）。結論扶正活血解毒中藥可下調ANE誘導的口腔黏膜成纖維細胞I型膠原的表達。

檳榔提取液；扶正活血解毒方；口腔黏膜成纖維細胞；I型膠原

研究表明大量咀嚼檳榔導致的口腔黏膜成纖維細胞增殖、膠原蛋白等細胞外基質的大量沉積是導致口腔黏膜下纖維化 （Oral Submucous Fibrosis,OSF）的重要病因之一[1-2]。OSF已被世界衛生組織定義為癌前狀態[3]。I型膠原蛋白（collagen type I)是膠原蛋白（collagen)的一種，它是一種結構蛋白，是細胞外基質的主要成分，其主要的功能是對組織細胞支持和連接的作用。研究發現I型膠原蛋白的高表達與許多的纖維化疾病的發生是密切相關的[4]，目前還發現I型膠原蛋白在多種腫瘤如舌癌[5]、頭頸鱗癌[6]、胰腺癌[7]等中也呈高表達。有資料顯示，I型膠原蛋白在OSF晚期和口腔鱗癌中表達顯著性增多并更具有活性[8-9]。因此，I型膠原蛋白可能在OSF及癌變發生和發展的過程中扮演一個非常重要的角色。近年來本院口腔科采用扶正活血解毒中藥治療OSF，取得良好療效[10]，本實驗通過觀察扶正活血解毒中藥含藥血清對檳榔提取液（areca nut extract，ANE）誘導的口腔黏膜成纖維細胞I型膠原分泌影響的作用，初步探討中醫藥體外抗OSF及癌變的作用及機制。

1 材料與方法

1.1 實驗試劑與儀器

DMEM 培養基 (GIBCO),胎牛血清（GIBCO），一抗 （兔抗 Collagen I，Abcam）， 二抗 （羊抗兔 IgG，Vector），DAB 試劑盒（Vector）,I型膠原 ELISA 試劑盒（北京中杉金橋生物技術有限公司）。扶正活血解毒方由丹參、當歸、紅花、生地黃、玄參、白花蛇舌草、生黃芪、薄荷等藥組成，藥材由湖南中醫藥大學第一附屬醫院制劑室提供，浸泡、煎煮、去渣，濃縮至藥液濃度為每毫升含生藥1 g，冷藏備用。ANE（按文獻方法[11]制備）。二氧化碳培養箱(M2300,Sheldon Manufacturing Inc), 酶標儀（ELM3000，美國）。

1.2 實驗方法

1.2.1 中藥血清的制備 成年健康SD大鼠32只，隨機分為4組（正常組和中藥低、中、高劑量組），每組8只，分別以蒸餾水、扶正活血解毒方4、8、16 g/kg（按照體表面積藥物劑量換算公式計算，分別相當70 kg成人劑量的 1、2、4 倍）灌胃，2 次/d，連續 5 d。大鼠末次灌胃1 h后,無菌條件下頸動脈采血，室溫靜置2 h，1 500轉/分離心10 min制備血清，56℃滅活30 min，0.22 μm濾器除菌后，用DMEM配制成含10%大鼠血清的培養液備用。

1.2.2 口腔黏膜成纖維細胞的培養與分組干預處理 口腔黏膜成纖維細胞的培養、鑒定及ANE誘導增殖按課題組前期實驗[11]介紹的方法進行。取第3代細胞分為5組：（1）正常組：正常大鼠血清；（2）實驗對照組： 正常大鼠血清+100 μg/mL ANE；（3）實驗組（分低、中、高劑量組）：低劑量扶正活血解毒方含藥血清+100 μg/mL ANE、中劑量扶正活血解毒方含藥血清+100 μg/ml ANE、高劑量扶正活血解毒方含藥血清+100 μg/mL ANE。將經鼠尾膠處理的蓋玻片植入24孔培養板孔內，細胞以5×104個/mL的密度接種植于蓋玻片上，每組6孔，培養48 h后，收集上清液，-80℃保存，用于ELISA檢測；培養細胞用4%多聚甲醛固定15 min后進行免疫細胞化學染色。

1.2.3 ELISA檢測上清液中Ⅰ型膠原含量 按試劑盒說明書操作，設置對照品組、樣品組及空白組，顯色后，以空白孔調零，在波長490 nm 處讀取OD值;以OD值為縱坐標，以對照品濃度為橫坐標，繪制標準曲線，根據所測得的OD值在標準曲線上計算出Ⅰ型膠原含量的相應濃度。

1.2.4 免疫細胞化學染色檢測Ⅰ型膠原的表達 免疫細胞化學染色主要步驟依次為:0.01MPBS漂洗，1%過氧化氫溶液10 min，0.01 MPBS漂洗，5%正常小牛白蛋白 （BSA）+0.3%TritonX-100室溫下封閉l h,吸棄封閉液，直接滴加一抗 (1∶500)，4℃過夜,0.01 MPBS 漂洗，加入二抗（1∶200），37 ℃孵育 l h；0.01 MPBS漂洗，加入ABC復合物，37℃孵育l h；0.01 MPBS，DAB顯色試劑盒37℃顯色,梯度酒精脫水，二甲苯透明，中性樹脂封片。用PBS替代一抗做陰性對照，排除二抗的非特異性染色。每片取5個視野，在高倍鏡下攝取圖像，采用圖像分析系統，測定免疫陽性細胞的灰度值,同時測量背底灰度值，計算其差值的絕對值,即得出免疫陽性細胞的相對灰度值。

1.3 統計處理

2 結果

2.1 ELISA檢測結果

ELISA結果顯示，實驗對照組培養液中Collagen I的含量比正常組顯著增高（P＜0.01）；加入扶正活血解毒方干預后各實驗組的Collagen I的含量均有所降低，中劑量組和高劑量組Collagen I的含量比實驗對照組顯著減少（P＜0.05）。見表1。

2.2 免疫細胞化學染色結果

Collagen I免疫陽性物質在正常口腔黏膜成纖維細胞胞漿中有表達，但染色較淺。實驗對照組Collagen I免疫陽性物質在胞漿中表達較強，染色較深，與正常組相比，免疫陽性細胞相對灰度值明顯要大（P＜0.01）。各劑量實驗組與實驗對照組相比，免疫陽性細胞相對灰度值均有所減小，并且隨劑量的增加而遞減，中劑量組和高劑量組的作用最明顯，差異有統計學意義（P＜0.05）。 見表 1，圖 1。

表1 扶正活血解毒中藥對ANE刺激下的Collagen I表達的影響 (±s,n=6)

表1 扶正活血解毒中藥對ANE刺激下的Collagen I表達的影響 (±s,n=6)

注:與正常組相比，△△P＜0.01；與實驗對照組相比，*P＜0.05。

組別正常組實驗對照組低劑量實驗組中劑量實驗組高劑量實驗組F P培養液（pg/mL）138±10.6 246±21.7△△221±20.8 157±13.2*150±12.7*51.064 0.000細胞（相對灰度值）41.4±3.8 73.1±6.9△△66.5±6.2 46.8±4.5*44.5±4.3*44.217 0.000

圖1 口腔黏膜成纖維細胞 Collagen I免疫化學染色

3 討論

膠原又稱膠原蛋白，是細胞外基質的主要成分，迄今已報道的膠原蛋白有20多類，膠原通常由3條肽鏈組成，每條單肽鏈稱α鏈。根據膠原在體內的分布和功能特點分為兩大類:成纖維膠原和非成纖維膠原。I型膠原屬成纖維膠原，主要由成纖維細胞、網織細胞、巨噬細胞和血管平滑肌細胞等生成[12]。I型膠原由2條α1-肽鏈和1條α2-肽鏈組成。I型膠原較粗大，交聯緊密，抗張力強，其含量高的組織不易伸展、僵硬度高。增生性瘢痕組織中以Ⅰ型膠原為主，瘢痕質地越硬，其含量越高[13]。I型膠原蛋白的高表達與纖維化疾病的發生是密切相關的，目前還發現I型膠原蛋白在多種腫瘤中也呈高表達，I型膠原蛋白可能與腫瘤的發生和發展密切相關。OSF是以膠原纖維堆積為主要病變特征具有癌變傾向的口腔黏膜病[14]，研究發現，口腔黏膜下纖維化隨病變程度進展的加深，Ⅰ型膠原的表達逐漸增加，OSF晚期和口腔鱗癌中Ⅰ型膠原的表達顯著性增多并更具有活性[9,15]，口腔黏膜下纖維化晚期患者出現固有層纖維彈性改變、上皮萎縮、口腔黏膜僵硬，張口受限，乃致不能進食，治療方法主要采用注射膠原酶溶解膠原纖維和手術切除纖維條索[16]。

中醫學認為，口腔黏膜下纖維化是由于嗜食辛辣燥熱之品，濕熱邪毒郁積局部，引起局部氣機不暢，日久氣滯血瘀，形成病損[17]。根據本病“毒瘀虛”互結的總體病機,我們采用扶正活血解毒中藥治療口腔黏膜下纖維化，臨床療效確切[10]。方中丹參、當歸、紅花活血化瘀,生黃芪、白芍益氣扶正,生地、玄參養陰清熱,白花蛇舌草、茵陳解毒散瘀;全方共奏扶正活血解毒之功。現代研究表明丹參及化學組分具有抗纖維化、抗腫瘤的藥理學作用[18-19],丹參素可減少高糖誘導的腹膜間皮細胞Ⅰ型膠原的分泌[20];白花蛇舌草含有黃酮、三萜類、甾醇類等多種抗腫瘤活性成分，其主要通過誘導腫瘤細胞凋亡、產生超氧化物、影響癌基因表達、增強免疫功能、干擾腫瘤細胞能量代謝等多種途徑起到抗腫瘤的作用[21]。本實驗采用ELISA、免疫細胞化學染色發現：正常培養的口腔黏膜成纖維細胞存在少量的Ⅰ型膠原表達，經檳榔提取物刺激后Ⅰ型膠原的含量明顯增多。扶正活血解毒中藥含藥血清作用于ANE刺激下的FB后，上清液和細胞中Ⅰ型膠原量均有所下降 （與ANE刺激組相比P＜0.05），提示這種拮抗Ⅰ型膠原的作用可能是其治療OSF的有效機制之一。

本實驗觀察到了ANE對口腔黏膜成纖維細胞I型膠原分泌的誘導作用及扶正活血解毒方的干預作用，然而Ⅰ型膠原的合成通路和降解通路是一系列復雜的分子事件，扶正活血解毒中藥干預通路中的哪一環節還有待進一步研究。

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Effect of Fuzheng Huoxue Jiedu Decoction on the Expression of Collagen I in Oral Mucosal Fibroblasts Induced by ANE

LUO Yujiao,YUE Jinbao,WU Dan,LIU Xun,LI Qun,TAN Jin*
(The First Affiliated Hospital of Hunan University of Chinese Medicine,Changsha,Hunan 410007,China)

ObjectiveTo observe the expression of collagen I in oral mucosal fibroblasts induced by ANE and the intervention of Fuzheng Huoxue Jiedu decoction.MethodsOral mucosal fibroblasts were cultured in vitro,ANE was used as an indicator,and Fuzheng Huoxue Jiedu decoction as intervention medicine.The expression of collagen I was measured by immunocytechemical method,and the content of collagen I was determined by ELISA.ResultsANE had promotion effect on the synthesis of collagen I in oral mucosal fibroblasts(P＜0.01),Fuzheng Huoxue Jiedu decoction drug serum had inhibition effect on the expression of collagen I induced by ANE (P＜0.05).ConclusionFuzheng Huoxue Jiedu decoction can inhibit the expression of collagen I in oralmucosal fibroblasts induced by ANE.

areca nut extract;Fuzheng Huoxue Jiedu decoction;oral mucosal fibroblasts;collagen I

R285；R593.2

A

10.3969/j.issn.1674-070X.2017.12.003

本文引用：羅玉姣，岳金寶，吳 丹，劉 尋,李 群，譚 勁.扶正活血解毒方干預ANE誘導口腔黏膜成纖維細胞I型膠原表達的實驗研究[J].湖南中醫藥大學學報，2017，37（12）：1308-1311.

2017-10-11

國家自然基金項目（81373701）。

羅玉姣，女，在讀碩士研究生，主要從事口腔黏膜病防治研究。

*譚 勁，男，教授，博士研究生導師，E-mail:tanjinhn@aliyun.com。

（本文編輯 匡靜之）