血府逐瘀湯對動脈粥樣硬化家兔主動脈組織單核細胞趨化因子-1表達的影響

李迎秋，張國民，朱義剛，劉 洋，肖海林，黎嘯風，夏 珊，周 晉，趙愛明,何清湖

(湖南中醫藥大學，湖南 長沙 410208)

血府逐瘀湯對動脈粥樣硬化家兔主動脈組織單核細胞趨化因子-1表達的影響

李迎秋，張國民*，朱義剛，劉 洋，肖海林，黎嘯風，夏 珊，周 晉，趙愛明,何清湖*

(湖南中醫藥大學，湖南 長沙 410208)

目的觀察血府逐瘀湯對動脈粥樣硬化家兔主動脈組織單核細胞趨化因子-1(monocyte chemotactic protein-1，MCP-1)表達的影響，并探討血府逐瘀湯抗動脈粥樣硬化的機制。方法將24只清潔級日本雄性大耳家兔，隨機分為3組，每組8只：空白組給予普通飼料；模型組先給予高膽固醇高脂飼料100 g/d后給予普通飼料；血府逐瘀湯組在模型組喂養的基礎上，灌胃給予血府逐瘀湯，每天1次。喂養8周后，采血測定家兔血脂全套(TG、TC、LDL)；應用光學顯微鏡觀察兔主動脈切片的病理改變，測定其主動脈粥樣硬化斑塊灰度及斑塊面積；利用免疫組織化學方法測定主動脈MCP-1蛋白的表達。結果主動脈圖像分析血府逐瘀湯組家兔胸主動脈斑塊灰度及斑塊面積分別低于模型組(P＜0.01)；與空白組及血府逐瘀湯組相比，模型組家兔血清TC，TG，LDL均明顯升高(P＜0.05)。血府逐瘀湯組家兔血清TC，LDL的水平卻明顯高于空白組(P＜0.01)。模型組家兔動脈粥樣硬化家兔主動脈MCP-1蛋白表達平均灰度值明顯高于血府逐瘀湯組和空白組(P＜0.01)。結論血府逐瘀湯可以降低動脈粥樣硬化家兔主動脈的MCP-1蛋白表達水平；血府逐瘀湯抗動脈粥樣硬化的機制可能與其降低MCP-1蛋白表達水平有關。

血府逐瘀湯；單核細胞趨化因子-l；動脈粥樣硬化；兔

隨著經濟增長人們生活方式的改變，我國動脈粥樣硬化（atherosclerosis，AS）發病率逐年增高，是人類心腦血管疾病的首位病因[1]。大量研究表明[2-4]：血府逐瘀湯具有抗AS的功效，但具體機制尚不完全清楚。在動脈粥樣硬化的發生發展過程中，單核細胞趨化因子-l(monocyte chemotactic protein-1，MCP-1)起重要作用[5]。血府逐瘀湯是否通過影響MCP-1的表達從而發揮抗AS的功效，尚未見相關的報道。本研究通過觀察血府逐瘀湯對動脈粥樣硬化家兔主動脈組織MCP-1表達的影響，探討血府逐瘀湯抗動脈粥樣硬化的可能機制。

1 材料與方法

1.1 動物

24只清潔級雄性日本大耳家兔，體質量(2.0±0.1)kg，由湖南中醫藥大學實驗動物中心采購，長沙天勤生物技術有限公司提供，合格證號 （SCXK(湘)2009-0012）。實驗環境設施合格證號 （SYXK(湘)2009-0001），分籠飼養，適應性喂養1周后開始實驗。

1.2 藥物及試劑

根據文獻[2]制備實驗用血府逐瘀湯，并去渣，濃縮至藥液生藥含量1 000 g/L滅菌后4℃冷藏保存備用。膽固醇購自中國醫藥集團上海化學試劑公司(批號 14023)。

1.3 主要儀器

日立全自動生化分析儀（日立，7170S型），Optimas彩色數字圖象分析儀（英國）。

1.4 動物分組

將24只清潔級日本雄性大耳家兔（SCXK(湘)2009-0012），隨機分為3組，每組8只：空白組給予普通飼料；模型組每日每只動物喂飼高膽固醇高脂飼料100 g，待其全部吃完后再喂飼普通飼料；血府逐瘀湯組予以高膽固醇高脂飲食造模同時，根據體質量灌胃給血府逐瘀湯(含生藥7.10 g/kg·d），每天1次。所有家兔均每周測定體質量1次，并根據體質量的變化調整灌胃給血府逐瘀湯的劑量（血府逐瘀湯組）或蒸餾水（空白組和模型組），灌胃時間共8周。

1.5 血標本及組織標本的采取與處理

各組家兔喂養8周后，禁飲禁食12 h，利用注射器從右心房緩慢抽血10 mL，置于生化管中立即送湖南中醫藥大學檢驗科檢測總膽固醇（TC）、甘油三酯（TG）、低密度脂蛋白（LDL）。 隨后處死家兔，距主動脈峽部0.5 cm處開始向遠心端取1 cm長的胸主動脈，置入10%福爾馬林液中備用。

1.5.1 TC，TG，LDL測定 所有血標本均采用盲法在湖南中醫藥大學附屬一醫院檢驗科全自動生化儀（日立，7170S 型）上測定 TC，TG，LDL。

1.5.2 家兔主動脈斑塊面積及斑塊灰度的測定 根據文獻提供的方法[2]，主動脈標本，依次經過脫水，透明，石蠟包埋，冷凍，常規切片，蘇木素-伊紅(HE)染色，制成組織切片。采用光學顯微鏡察其病理改變，隨后每個切片隨機取3個視野，利用Optimas顯微圖像分析系統檢測家兔主動脈斑塊灰度以及斑塊面積。

1.5.3 主動脈MCP-1蛋白表達的測定 上述主動脈組織切片完成后，嚴格按照試劑說明書和免疫組織化學方法操作。細胞膜、胞漿呈棕黃色顆粒黃染，提示MCP-1陽性，無黃染者提示為MCP-1陰性。每個主動脈標本隨機選取4張切片，每張切片再隨機選取5個高倍視野檢測MCP-1蛋白表達的灰度值，取平均灰度值進行比較，平均灰度值越高，說明MCP-1陽性表達越強，反之則MCP-1陽性表達越弱。

1.6 統計學方法

2 結果

2.1 各組家兔主動脈粥樣硬化的病理形態學改變

肉眼觀察：空白組家兔主動脈內膜正常，無明顯病理改變；模型組家兔主動脈內膜散在分布大量的向內隆起的淡黃色斑塊，形狀不規則，甚至沿管腔呈環狀分布；血府逐瘀湯組家兔主動脈內膜有少量淡黃色斑塊形成，隆起不明顯，淡黃色斑塊呈間斷分布，很少連成片。光鏡檢查：空白組主動脈內膜光滑平整，內皮膜下未見脂質沉積；模型組主動脈內有大量斑塊形成，斑塊內有大量的泡沫細胞和增生的平滑肌細胞聚集；血府逐瘀湯組主動脈可見少許斑塊內，斑塊內間散在的泡沫細胞，但無增生的平滑肌細胞 (見圖1)。主動脈圖像分析血府逐瘀湯組家兔胸主動脈斑塊灰度（157.29±8.95）及斑塊面積[（2.13±0.57） mm2]分別低于模型組[（187.56±6.71）mm2和（4.93±0.58）mm2，P＜0.01]。 見表 1。

圖1 各組家兔主動脈粥樣硬化的病理形態學改變(HE，×400)

表1 血府逐瘀湯對家兔主動脈斑塊灰度及斑塊面積的影響（±s）

表1 血府逐瘀湯對家兔主動脈斑塊灰度及斑塊面積的影響（±s）

注:與模型組比較,*P＜0.01。

分組空白組模型組血府逐瘀湯組n 8 8 8斑塊灰度-187.56±6.71 157.29±8.95*斑塊面積/mm2-4.93±0.58 2.13±0.57*MCP-1 112.46±6.16 165.38±8.15 131.67±9.13

2.2 血府逐瘀湯對家兔血清TC，TG，LDL的影響

與空白組及血府逐瘀湯組相比，模型組家兔血清 TC，TG，LDL均明顯升高 (P＜0.05)。 與空白組相比，血府逐瘀湯組家兔血清TG無顯著性差異，但是血府逐瘀湯組家兔血清TC，LDL的水平卻明顯高于空白組(P＜0.01)。 見表 2。

表2 血府逐瘀湯對家兔血清TC，TG，LDL的影響（±s，n=8，mmol·L-1）

表2 血府逐瘀湯對家兔血清TC，TG，LDL的影響（±s，n=8，mmol·L-1）

注:與空白組比較，＃P＜0.05，##P＜0.01；與模型組比較,*P＜0.01。

分組空白組模型組血府逐瘀湯組TC 1.73±0.41 27.36±6.95##16.43±5.73##*TG 1.09±0.31 2.39±0.61##1.41±0.27*LDL 1.12±0.27 19.37±9.54##8.98±2.67＃*

2.3 血府逐瘀湯對動脈粥樣硬化家兔主動脈MCP-1蛋白表達的影響

MCP-1蛋白表達陽性表現呈棕黃色顆粒，位于胞膜及胞漿內。各實驗組MCP-1的陽性表達主要見于新生內膜，中膜也有表達(見圖2)。用病理圖像分析系統測定空白組平均灰度值為（112.46±6.16），模型組平均灰度值為（165.38±8.15），血府逐瘀湯組平均灰度值為（131.67±9.13）。空白組及血府逐瘀湯組平均灰度值明顯低于模型組(P＜0.01)。見表1。

圖2 各組家兔主動脈動脈MCP-1蛋白表達情況(免疫組化，×400)

3 討論

已經證實，MCP-1在動脈粥樣硬化斑塊的形成和破裂中起著重要的作用[6]。表達在血管內皮細胞表面的MCP-1與表達于單核細胞表面的主要受體是趨化因子受體 2（chemokine receptor， CCR-2）結合后，通過細胞膜上G蛋白藕聯的磷酸肌醇等信號通路特異性趨化激活單核細胞，并趨化其遷移入血管內皮下，在巨噬細胞集落刺激因子的作用下分化為巨噬細胞，大量攝取氧化型極低密度脂蛋白，膽固醇在巨噬細胞內聚集，最終使巨噬細胞轉變為泡沫細胞[7]。同時，MCP-1/CCR-2可以上調粥樣斑塊里的內皮細胞Bax及下調Bcl-2表達，誘導血管內皮細胞凋亡，導致血管張力、脂質代謝及凝血機制的改變，促進動脈粥樣硬化板斑塊的形成[8-9]。還有研究證實，MCP-1可以誘導巨噬細胞表達基質金屬蛋白酶9（matrix metalloproteinase，MMP-9），降解細胞外基質膠原蛋白，導致動脈粥樣斑塊不穩定甚至破裂[10]。臨床上也有大量的研究證實，動脈粥樣斑塊塊內MCP-1的水平明顯高于空白組組織，不穩定斑塊內MCP-1的表達水平較穩定斑塊增多，急性冠脈綜合癥患者血清的MCP-1水平高于穩定型心絞痛患者和健康人群[11]。而且，MCP-1水平對ACS患者的近期預后和遠期預后均有獨立的預測價值[12]。總之，MCP-1與動脈粥樣硬化的發生發展密切相關，MCP-1可能成為治療動脈粥樣硬化的一個新靶點[13]。

在本研究中，與模型組相比，血府逐瘀湯組家兔主動脈粥樣硬化病變程度較明顯減輕。而且，血府逐瘀湯組家兔主動脈粥樣硬化斑塊灰度和斑塊面積這兩個動脈粥樣硬化病變程度的客觀指標也明顯低于模型組，說明血府逐瘀湯具有抗動脈粥樣硬化的作用，這與包括本課題組前期研究在內的國內外大量研究結果一致[2-3]。但是，目前尚未發現相關血府逐瘀湯通過影響MCP-1發揮其抗動脈粥樣硬化作用的研究報道。本文結果顯示，與模型組相比，血府逐瘀湯組家兔主動脈MCP-1蛋白表達水平明顯降低，說明血府逐瘀湯可能通過降低動脈粥樣硬化家兔MCP-1蛋白表達水平，從而發揮抗動脈粥樣硬化的作用。

血府逐瘀湯降低動脈粥樣硬化家兔主動脈的MCP-1蛋白表達的確切機制，目前未見相關的研究。有研究證實，高脂血癥損傷血管內皮細胞，激活血管壁的炎性反應，誘導血管內皮細胞MCP-1的表達[14]。而在本研究中血府逐瘀湯組家兔血清TC，LDL明顯低于模型組，故可以推測血府逐瘀湯可能是通過降低血清TC，LDL水平，減輕高脂血癥對血管內皮細胞的損傷，從而降低主動脈血管內皮細胞MCP-1的表達，確切的機制有待進一步研究。

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Effects of Xuefu Zhuyu Decoction on the Expression of Monocyte Chemoattractant Protein-1 in Aortic Tissue of Atherosclerosis Rabbits

LI Yingqiu,ZHANG Guomin*,ZHU Yigang,LIU Yang,XIAO Hailin,LI Xiaofeng,XIAN Shan,ZHOU Jin,ZHAO Aiming,HE Qinghu*
(Hunan University of Chinese Medine,Changsha,Hunan 410007,China)

ObjectiveTo observe the effect of Xuefu Zhuyu decoction on the expression of monocyte chemoattractant protein-1 (MCP-1)in aortic tissue of atherosclerosis rabbits.MethodsTwenty-four male rabbits were randomly divided into three groups,8 rats in each group.The control group was fed with normal diet,the model group was given with 100g/d high fatand cholesteroldietbeforefeedingnormaldiet;and Xuefu Zhuyu decoction group wasadministrated with Xuefu Zhuyu decoction,once daily.The concentrations of serum total cholesterol (TC)，total triglyceride(TG),low density lipoprotein(LDL)were measured after eight weeks for feed.The pathology changes of the pathological section,degree and atherosclerotic plaque mean gray value and plaque area were observed by optical microscope.The expression of MCP-1 in atherosclerosis rabbits was detected by immunochemistry.ResultsThe aortic atherosclerotic plaque mean gray value and plaque area of Xuefu Zhuyu decoction group were low er than those of the model group (P＜0.01).Compared with the blank group and Xuefu Zhuyu decoction group,the serum TC,TG and LDL of the model group increased obviously (P＜0.05).The level of TC and LDL in Xuefu Zhuyu decoction was significantly higher thabn those in blank group (P＜0.01).The average gray value of the expression of MCP-1 in the model group was significantly higher than those in the Xuefu Zhuyu decoction group and blank group (P＜0.01).ConclusionXuefu Zhuyu decoction could decrease the expression of MCP-1 in aortic tissue of atherosclerosis rabbits.Its mechanism may be related with the lower MCP-1.

Xuefu Zhuyu decoction;monocyte chemoattractant protein-1;atherosclerosis;rabbits

R285.5

A

10.3969/j.issn.1674－070X.2017.12.004

本文引用：李迎秋，張國民，朱義剛，劉 洋，肖海林，黎嘯風，夏 珊，周 晉，趙愛明,何清湖.血府逐瘀湯對動脈粥樣硬化家兔主動脈組織單核細胞趨化因子-1 表達的影響[J].湖南中醫藥大學學報，2017，37（12）：1312-1315.

2017-01-10

國家自然科學基金面上項目(81373641);2012年度湖南省大學生研究性學習和創新性實驗計劃項目（2012181）；2013年度湖南省中醫藥科研計劃項目（2013161）；2014年湖南省科學技術廳課題（2014SK3050）。

李迎秋，女，講師，主要從事中西醫結合男科和老年病研究。

*何清湖，男，教授，博士研究生導師，E-mail:hqh1111@tom.com；張國民，男，教授，碩士研究生導師，E-mail:834095773@qq.com。

（本文編輯 李 杰）