加味地黃飲子方干預自然衰老鼠與正常成年鼠免疫功能的對比性研究*

( 150040)

黑龍江中醫藥大學附屬第一醫院

加味地黃飲子方干預自然衰老鼠與正常成年鼠免疫功能的對比性研究*

高山謝寧Δ王海艷ΔΔ唐偉懿Δ馬嫡Δ(哈爾濱150040)

黑龍江中醫藥大學附屬第一醫院

目的：比較加味地黃飲子方對自然衰老鼠與正常成年鼠免疫功能的影響。方法：選取SD雄性大鼠，24月齡20只作為自然衰老實驗組，選取12月齡20只作為正常成年對照組。2組大鼠給予加味地黃飲子灌胃，8周后檢測免疫指標。比較2組間白細胞計數、中性粒細胞比例、淋巴細胞比例，比較T細胞CD4+、CD8+、CD3+比例，比較NK細胞、巨噬細胞、B細胞比例，比較IgA、IgG、IgM含量的差異 。結果：自然衰老組大鼠的淋巴細胞比例升高；T 細胞CD4+和CD3+比例升高、CD8+比例降低；NK細胞、巨噬細胞、B細胞比例升高；IgA、IgG、IgM含量升高。結論：加味地黃飲子方可以提高自然衰老大鼠的免疫功能，可通過影響免疫功能發揮延緩衰老的作用。

加味地黃飲子方；自然衰老鼠；正常成年鼠；免疫功能；對比性研究

衰老是自然界最復雜的生理現象之一,是任何生物都不能避免的生命過程。人體在遺傳因素調控下，隨著時間推進逐漸成熟，而后出現各系統、漸進性、不可逆轉的自然衰老。本課題擬從對免疫系統功能影響的角度，對加味地黃飲子抗衰老的內在機制進行初步探討。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 自北京維通利華公司購入雄性24月齡SD大鼠20只為自然衰老實驗組，12月齡大鼠20只為正常成年對照組。

1.2 藥物制備與試劑 加味地黃飲子方由古方地黃飲子化裁而成，去掉附子，肉桂變為桂枝，加入人參、血竭、珍珠等藥物。加味地黃飲子方水煎劑的制備：將3劑成人劑量的加味地黃飲子飲片(共453 g)浸泡2 h，然后武火加熱，煮沸后改用文火慢煎30 min，取煎液2次將其混合過濾，再將濾液文火煎煮濃縮至220 mL(藥液含生藥量2.059 g/mL,黑龍江中醫藥大學中醫基礎理論實驗室煎制)。NK1.1、CD11b、F4/80、CD4抗體(美國BD公司)，大鼠 IgA、IgG、IgM ELISA 試劑盒(杭州聯科公司)。

1.3 實驗儀器 流式細胞儀 6HT(武漢科力瓦貿易有限公司)，全自動血液分析儀 BC-1800(山東博科生物產業有限公司)，EnVision R 多功能酶標儀(上海珀金埃爾默有限公司)。

1.4 干預方法 2組大鼠釆用加味地黃飲子20.6 g/kg·d-1的劑量灌胃，每日1次，觀察8周。

1.5 指標測定 給藥后第 4、8周，大鼠眼內眥取血，EDTA-K3 抗凝，血細胞計數儀測定外周血白細胞計數、淋巴細胞比例、中性粒細胞比例。流式細胞儀檢測T淋巴細胞分型中CD4+、CD8+、CD3+細胞比例。檢測外周血NK細胞、巨噬細胞、B細胞比例。檢測外周血 IgA、IgG、IgM值。

2 結果

2.1 白細胞計數、中性粒細胞比例、淋巴細胞比例比較 對比白細胞計數發現，成年鼠白細胞計數在4周與8周比較差異無顯著性(P>0.05);老年鼠8周白細胞計數較4周有所下降(P<0.05)，老年鼠4、8周白細胞計數明顯低于成年鼠(P<0.05)。對比中性粒細胞比例發現，成年鼠8周中性粒細胞比例較4周有所提高(P<0.05)，而老年鼠8周中性粒細胞比例較4周有所下降(P<0.05)；老年鼠4周中性粒細胞比例與成年鼠比較差異無顯著性(P>0.05)，老年鼠8周中性粒細胞比例明顯低于成年鼠(P<0.05)。對比淋巴細胞比例發現，成年鼠淋巴細胞比例在4周與8周比較差異無顯著性(P>0.05)，老年鼠8周淋巴細胞比例較4周有所上升(P<0.05)，且老年鼠8周淋巴細胞比例明顯高于成年鼠(P<0.05)，而老年鼠4周淋巴細胞比例與成年鼠比較差異無顯著性(P>0.05)。詳見表1。

組別n白細胞(×1000個/μm3)4周8周中性粒細胞(%)4周8周淋巴細胞(%)4周8周成年組2010.3±1.911.5±1.756.7±13.180.8±20.4*44.6±13.749.5±1.06老年組206.5±1.2#4.2±1.1#*62.6±19.534.4±10.3#*47.3±21.765.8±22.1#*

注：與成年組比較，#P<0.05；與組內4周比較，*P<0.05

2.2 T淋巴細胞分型比例比較 對比CD4+T細胞比例發現：成年鼠和老年鼠8周CD4+比例較4周有明顯的提高(P<0.05)，且老年鼠4、8周CD4+比例明顯低于成年鼠(P<0.05)。對比CD8+T細胞比例發現：成年鼠和老年鼠8周CD8+比例較4周有明顯的下降(P<0.05)，老年鼠4、8周CD8+比例明顯高于成年鼠(P<0.05)。對比 CD3+細胞比例發現：成年鼠和老年鼠8周CD3+比例較4周有明顯的提高(P<0.05)，老年鼠4、8周CD3+比例明顯低于成年鼠(P<0.05)。詳見表2。

組別nCD4+4周8周CD8+4周8周CD3+4周8周成年組2061.4±15.992.3±9.7*50.4±8.7 36.9±12.3* 57.4±1.685.6±8.8* 老年組2025.7±3.1#70.6±21.4#75.2±14.0#53.1±10.9#*32.8±5.5#62.0±11.1#*

注：與成年組比較，#P<0.05；與組內4周比較，*P<0.05

2.3 NK細胞、B細胞、巨噬細胞比例比較 對比NK細胞比例發現：成年鼠和老年鼠8周NK細胞比例較4周分別有明顯上升(P<0.05)，老年鼠4、8周NK細胞比例明顯低于成年鼠(P<0.05)。對比B細胞比例發現：成年鼠和老年鼠8周B細胞比例較4周有明顯的上升(P<0.05)，老年鼠4、8周B細胞比例明顯低于成年鼠(P<0.05)。對比巨噬細胞比例發現：成年鼠和老年鼠8周巨噬細胞比例較4周有明顯的上升(P<0.05)，8周巨噬細胞比例老年鼠與成年鼠比較差異無顯著性(P>0.05)，老年鼠4周巨噬細胞比例明顯低于成年鼠(P<0.05)。詳見表3。

2.4 IgA、IgG、IgM含量比較 對比 IgA含量發現：成年鼠和老年鼠8周IgA含量較4周有明顯上升(P<0.05)，老年鼠4、8周IgA含量明顯低于成年鼠(P<0.05)。對比IgG含量發現：成年鼠和老年鼠8周IgG含量較4周有明顯上升(P<0.05)，老年鼠4、8周IgG含量明顯高于成年鼠(P<0.05)。對比IgM含量發現：成年鼠和老年鼠8周IgM含量較4周有明顯上升(P<0.05)，4、8周IgM含量老年鼠與成年鼠比較差異無顯著性(P>0.05)。詳見表4 。

組別nNK細胞4周8周B細胞4周8周巨噬細胞4周8周成年組2053.2±1.182.5±18.8*55.4±12.177.9±18.1*61.2±21.581.7±23.2*老年組2045.7±25.4#62.4±15.1#*38.4±6.7#50.6±8.8#*32.4±25.0#77.3±30.4*

注：與成年組比較，#P<0.05；與組內4周比較，*P<0.05

組別nIgA4周8周IgG4周8周IgM4周8周成年組2032.7±14.880.5±19.3*26.8±9.4 49.2±15.3*70.1±12.3114.5±36.2*老年組2015.3±3.3#52.9±12.7#*53.4±16.9#76.2±14.0#*68.3±9.7△90.6±25.7*

注：與成年組比較，#P<0.05，△P>0.05；與組內4周比較，*P<0.05

3 討論

研究發現人體免疫系統的功能隨時間不斷進行調整重塑，隨年齡增長功能不斷下降，呈現老化狀態。[1]對生理年齡較長的人群，如百歲老人進行研究，發現其免疫系統功能良好，保持在較高的水平運行。據分析免疫功能的完好與長壽存在相關性。在衰老過程中淋巴細胞明顯生成減少、凋亡較高，而出現整體水平下降。[2]免疫系統對抗原的應答水平也隨之下降，所以老年人群多見容易感染、腫瘤高發的現象。老年人在疾病過程中外界抗原和病原體不斷刺激并消耗T淋巴細胞。大量實驗證實T細胞因為凋亡受損發生克隆性擴增。[3]進入老齡期后人體老化代表細胞T細胞CD8+比例上升，而清除腫瘤細胞起著極其重要作用的CD4+數量下降。[4]衰老使B淋巴細胞的數量和功能下降。細胞內環境紊亂導致B細胞分泌免疫球蛋白減少，破壞B細胞的形成，使免疫球蛋白的多樣性和黏附性下降。[5]研究表明老年人和老齡鼠的B細胞存在協同刺激因子的減少、受體信號減弱等內在缺陷，起保護作用的免疫球蛋白親和性和滴度下降。NK細胞通過細胞毒作用對抗、殺滅腫瘤細胞。老年期NK細胞的細胞毒作用大幅降低，如果保持相應的抗腫瘤作用，就需要更多數量的NK細胞來補充足量的細胞溶解能力。[6]

中醫藥延緩衰老的作用受到日益廣泛的關注，其研究也越來越深入。在臨床大量應用中，筆者觀察到地黃飲子加減方對改善早衰癥狀有很好的的作用。本實驗對加味地黃飲子通過影響免疫功能發揮抗衰老的作用進行深入的研究，筆者對正常的成年大鼠和自然衰老大鼠進行加味地黃飲子干預，觀察它們免疫系統的變化。對比研究發現加味地黃飲子可不同程度的提高自然衰老大鼠淋巴細胞比例，提高正常的成年鼠和自然衰老大鼠CD4+和CD3+細胞比例，降低CD8+細胞比例，提高正常的成年鼠和自然衰老鼠NK細胞、B細胞、巨噬細胞比例和血漿 IgA、IgG、IgM的含量。地黃飲子方具有開竅、化痰、補腎、活血的功效，方藥組成中的有效成分為延緩自然衰老發揮了重要的藥理作用。[7-9]影響自然衰老的因素很多如氧化應激衰老、間質損傷衰老、糖基化終產物衰老等，這也是我們今后可能的研究方向。本實驗從加味地黃飲子方對免疫系統的影響粗淺分析其延緩衰老的內在原因，試圖從多方面、多角度、多層次去探討加味地黃飲子方延緩衰老的作用機制。

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ComparativeStudyofInterventionofJiaweiDihuangYinziFangonImmuneFunctioninNaturalAgingRatsandNormalAdultRats

GAOShanXIENingWANGHai-yanTANGWei-yiMADi(Harbin 150040)

First Affiliated Hospital,Heilongjiang University of Chinese Medicine

Objective: to compare the effects ofJiaweiDihuangYinziFangon the immune function in natural aging rats and normal adult rats. Methods: 20 SD male rats of 24 months old were selected as experimental group of natural aging, and 20 rats of 12 months old as normal adult control group. Both groups were treated with intragastric administration withJiaweiDihuangYinziFangto detect immunological index after 8 weeks. Compare white blood cell count the proportions of neutrophils and lymphocytes in the 2 groups, compare the proportions of T-cells of CD4+, CD8+and CD3+, compare the proportions of NK cells, macrophages and B cells, and compare the differences of IgA, IgG and IgM contents. Results: In natural aging group, lymphocytes increased; CD4+and CD3+increased; CD8+decreased; NK cells, macrophages and B cells increased; and the contents of IgA, IgG and IgM increased. Conclusion:JiaweiDihuangYinziFangcan improve the immune function of natural aging rats, and can play the role of anti-aging by affecting immune function.

JiaweiDihuangYinziFang; natural aging rat; normal adult rat; immune function; comparative study

R285.5

A

1007-5615(2017)06-0004-04

* 國家自然科學基金資助項目：No.81573863；哈爾濱市科技局青年后備人才項目：No.2017RAQXJ170

Δ 黑龍江中醫藥大學(哈爾濱 150040)

ΔΔ 黑龍江省中醫醫院(哈爾濱 150036)

謝寧，男，教授，博士生導師。

(2017-10-17 收稿)