淺談對微生物限度檢查：微生物計數法的相關思考

劉慶慶 劉巍

摘 要： 筆者針對中國藥典2015 年版非無菌產品微生物限度檢查：微生物計數法的主要增修訂情況進行了相關解讀。

關鍵詞： 微生物限度檢查；計數法

0 引言

2014 年3月28日，國家藥典委員會發布了《中國藥典》2015年版通則征求意見稿（通則公示稿），與《中國藥典》2010 年版比較，2015年版在微生物限度檢查方法和指導原則上均做了較大的修訂。修訂的內容主要包括了非無菌產品微生物限度檢查：微生物計數法（ 通則1105）、非無菌產品微生物限度檢查：控制菌檢查法（通則1106）及非無菌藥品微生物限度標準（通則1107）等，修訂后的微生物限度檢查方法與《美國藥典》基本一致。這對于需要進口或出口的藥品生產企業來說，因檢測方法基本一致，檢測結果將具有可比性，并減少了資源浪費。

1 藥品微生物限度檢查法的變遷

1995 年版《中國藥典》第一次提出藥品微生物限度檢查法，2005 年版《中國藥典》第一次提出要對所有用于檢查藥品微生物的方法進行方法學驗證，以防因檢驗方法不科學造成漏檢或誤判；2010 年版《中國藥典》中則又一次強調了進行微生物檢驗方法學驗證的重要性，強調方法確認過程；2015年版《中國藥典》將方法學驗證修訂為方法適用性試驗，更加重視對于檢驗全過程的控制，達到試驗條件、檢驗方法和判定標準三者的統一，使檢驗結果更具可比性，真正做到與國際標準接軌。

2 藥品微生物計數方法的建立和確認

2.1 檢驗方法的選擇

藥品微生物計數方法通常包括平皿法、薄膜過濾法和最可能數法（簡稱MPN 法）。平皿法應用較廣，是最常用的微生物計數方法，也是方法適用性試驗的首選；薄膜過濾法適用于有較強抑菌作用且具較強溶液性的供試品；最可能數法因其精確度較差，更適合于某些受微生物污染程度較小的供試品。在選擇計數方法時，首先應根據供試品的理化特性和微生物限度標準，選擇操作簡便、快速的方法；其次應考慮供試品的抑菌性，在使用中和劑或消除抑菌作用時應避免損傷供試品中污染的微生物。選擇方法后應對所選方法的適用性進行確認。

2.2 檢驗方法的建立

一般來說，多數中成藥制劑都需要進行需氧菌總數計數，通常應依據藥品自身的特點和標準限值，來擬定檢驗方法，并對計數方法進行適用性試驗，并確認其結果的有效性。例如，實驗室采用不同的方法測定某中成藥口服液的需氧菌總數，由于中藥制劑受微生物污染的可能性較大，故先擬定平皿法和薄膜過濾法為檢驗方法，并對此方法進行適用性試驗。

2.2.1 供試液的制備

取供試品10g，加入pH7.0 的無菌氯化鈉- 蛋白胨緩沖液至100 mL，充分振搖使其溶解，制成1∶10 比例的均勻供試液備用。

2.2.2 菌液制備

接種金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌以及枯草芽孢桿菌的新鮮培養物到胰酪大豆胨液體培養基中，在35℃的溫度下培養18～24 h，并將此培養物用0.9% 無菌氯化鈉溶液稀釋至菌落數約為104 cfu/mL 的菌懸液。

2.2.3 試驗方法

（1）平皿法試驗組：取上述供試液9.9 mL，加入上述菌懸液0.1 mL，使之充分混合均勻，吸取1 mL 混合液至無菌平皿中，然后傾注胰酪胨大豆瓊脂培養基，混合均勻，凝固，需平行制備2個平皿，在35℃溫度下培養3 d。

（2）薄膜過濾法試驗組：試驗前應先將少量的pH7.0的無菌氯化鈉- 蛋白胨緩沖液濾過，以潤濕濾膜，然后取上述供試液1mL，加入100 mL上述稀釋液，充分混勻，全量濾過后以此稀釋液沖洗濾膜，每次沖洗100mL，沖洗3次，總沖洗量為300mL，在第3次沖洗液中加入不高于100cfu的試驗菌液，混合均勻后抽濾，然后轉移濾膜，使其菌面朝上貼在胰酪大豆胨瓊脂培養基平板上，在35℃的條件下培養3d。

供試品對照組：取以上供試液，用稀釋液代替菌液同試驗組進行操作。菌液對照組：用稀釋液代替供試液，按試驗組方法加入試驗菌液。

3 計數法適用范圍的變化

3.1 嗜溫細菌和真菌的計數

修訂后的微生物計數法系用于能在有氧條件下生長的嗜溫細菌和真菌的計數。與醫藥相關的細菌大多數是嗜溫的，其生長溫度為20～40℃，真菌是一類重要的致病源，人類最常見的真菌病原體可以分為酵母、霉菌和皮膚真菌。盡管嗜溫細菌、真菌是影響藥物安全性最主要的因素，其他與特定藥品相關微生物也需要關注其有害性。新版藥典以微生物的生理特點和生長特性為依據，科學地將細菌數修訂為需氧菌總數（定義為生長在胰酪大豆胨瓊脂培養基上所有菌落，也包括霉菌和酵母菌），霉菌和酵母菌數修訂為霉菌和酵母菌總數（一般指生長在沙氏葡萄糖瓊脂上的所有菌落，也包括細菌菌落數）。如果由于細菌的生長而使霉菌和酵母菌的計數結果不符合微生物限度要求，可使用含有抗生素的沙氏葡萄糖瓊脂培養基重新進行計數。

3.2 新版藥典計數法不適用于活菌制劑的檢查

微生態活菌制品是由非致病的活菌組成，本身即是微生物，因此新版藥典第三部各論項下的微生態活菌制品總論對其檢測有專門規定。修訂后的非無菌產品微生物計數法明確了其不適用于活菌制劑的檢查，增加了中國藥典2010年版一、二部未規定的事項，方法的應用范圍更加明晰、嚴謹。

3.3 明確了可采用替代法

可采用自動檢測等方法替代藥典方法，但須證明替代方法等效于藥典規定的方法。這一原則使得方法更具科學性、時代性、開放性和靈活性，有利于鼓勵方法創新和現代儀器設備的使用，促進檢測技術的發展。

3.4 增加了檢測產品范圍

新版藥典規定微生物計數法適用于生物制品和醫療器械等其他產品，強調了除藥品外的其他醫藥產品也可應用。

4 計數法檢測環境的變化

中國藥典2010年版規定微生物限度檢查應在環境潔凈度10000級下的局部潔凈度100 級單向流空氣區域內進行。而2010 年版《藥品生產質量管理規范》，引入了動態連續監測，將藥品生產所需的潔凈區分為A、B、C、D 4 個級別。各國藥典對檢驗檢測環境通常只做出了在適宜的潔凈度的環境中進行的要求。基于我國國情，新版藥典對檢驗檢測環境僅做原則性要求，試驗環境必須符合微生物限度檢查的要求。但在通則9203 藥品微生物實驗室質量管理指導原則中給出具體指導意見，微生物計數試驗應在受控潔凈環境下的局部潔凈度不低于B 級的單向流空氣區域內進行。對出具法定藥品檢驗報告書的實驗室，檢驗環境低于生產環境將會導致報告書的權威性受到挑戰，從長遠的觀點看，檢驗環境應不低于生產環境。

5 計數檢測用試劑試藥的變化

污染微生物在供試品中的分布具有隨機性、不均勻性的特點，供試液制備過程中，中和劑、滅活劑和表面活性劑應對微生物生長無毒，相互間具有相容性，有利于供試品中微生物均勻分布，提高計數的準確性以真實反映藥物的微生物污染狀況。中國藥典2015年版新增了“供試液制備時如果使用了表面活性劑，應確認其對微生物無毒性及所使用中和劑或滅活劑的相容性”的要求。相容性要求供試品不一定要完全溶解于稀釋液中，但要均勻分散，形成均一、穩定的供試液分散體系，這是獲得高準確性和良好檢驗結果的基礎。

結語

新版藥典微生物檢查體系在樣品前處理、微生物選擇性培養和鑒定確認等方面的規定更為靈活，為檢驗技術的創新發展提供了空間，有利于藥品質量從最終產品檢驗向過程控制轉變。通過增修訂，新版藥典藥品微生物控制標準體系不僅實現了中國藥典三部通則的統一，且解決了中國藥典與ICH 協調案的協調問題，完全實現了與國際標準的接軌，必將為推動我國藥品標準及藥品的國際交流與貿易做出積極貢獻。

參考文獻

[1] 國家藥典委員會. 中華人民共和國藥典：2015 年版四部. 北京：中國醫藥科技出版社，2015.

[2] 胡昌勤. 藥品微生物控制現狀與展望. 中國藥學雜志，2015，50（20）：1747-1751.