5-甲基胞嘧啶
——高等生物的主要表觀遺傳標(biāo)記

劉卓 潘攀

（張家港市第一人民醫(yī)院腫瘤科 江蘇 張家港 215600）

引言

DNA中堿基的化學(xué)修飾近年來一直是生命科學(xué)領(lǐng)域研究的熱點(diǎn)之一。主要的DNA修飾包括腺嘌呤的甲基化和脫氨基，胞嘧啶的甲基化、羥甲基化和羧基取代，鳥嘌呤的氧化等，雖然這些修飾堿基的比例較低，但它們或者是細(xì)胞的生理活動所必需的，或者與細(xì)胞的病理發(fā)生密切相關(guān)，而且在物種間具有高度保守性和獨(dú)特性[1]。DNA甲基化主要形成5-甲基胞嘧啶（5mC）和少量的N6-甲基腺嘌呤及7-甲基鳥嘌呤[2]。其中，胞嘧啶第5位碳原子上的甲基化動態(tài)修飾研究得較為深入。在上世紀(jì)早期，科學(xué)家首次用實(shí)驗(yàn)證明甲基化胞嘧啶是生物體內(nèi)天然存在的化合物[3]，修飾之后的堿基稱為5-甲基胞嘧啶，簡稱為5mC。1951年，DNA中5mC的存在被Wyatt第一次報道[4]。

1.5mC和5hmC在基因表達(dá)調(diào)控中的基本作用

5mC是高等真核生物表觀遺傳修飾的主要形式，5hmC是5mC的羥基化形式，被稱為DNA的第6種堿基，它最早于1952年在噬菌體DNA中被發(fā)現(xiàn)，它能被糖基轉(zhuǎn)移酶介導(dǎo)糖基化修飾，從而使噬菌體基因組在進(jìn)入宿主后能抵抗宿主限制酶的降解[5]。5hmC與5mC一樣參與基因表達(dá)調(diào)控。一系列成果證實(shí)Tet1蛋白能調(diào)控CpG富集啟動子處的DNA甲基化與羥甲基化水平，進(jìn)而能促進(jìn)干細(xì)胞中與多能性相關(guān)的因子的轉(zhuǎn)錄，使干細(xì)胞保持多能性[6]。為了具體探明甲基化與基因表達(dá)調(diào)控的關(guān)系，科學(xué)家在基因組層面測定了5mC和5hmC的存在位點(diǎn)[7]，結(jié)果表明5mC主要導(dǎo)致基因的沉默，5hmC主要導(dǎo)致基因的激活，這可能因?yàn)?hmC是基因去甲基化的先兆。

在基因啟動子區(qū)內(nèi)CpG位點(diǎn)上，甲基化可能通過3種方式影響該基因轉(zhuǎn)錄活性[8]：

（1）DNA序列甲基化直接阻礙轉(zhuǎn)錄因子的結(jié)合。

（2）甲基CpG結(jié)合蛋白(methyl2CpG2bindingproteins,MB Ps)結(jié)合到甲基化CpG位點(diǎn),與其他轉(zhuǎn)錄復(fù)合抑制因子相互作用或招募組蛋白修飾酶改變?nèi)旧|(zhì)結(jié)構(gòu)。

（3）染色質(zhì)結(jié)構(gòu)的凝集阻礙轉(zhuǎn)錄因子與其調(diào)控序列的結(jié)合。

以上三種抑制轉(zhuǎn)錄的途徑均需要通過改變?nèi)旧|(zhì)構(gòu)型來實(shí)現(xiàn)。目前已經(jīng)證實(shí)，在CpG島上的DNA甲基化能夠改變?nèi)旧|(zhì)的構(gòu)型[8]。在決定DNA構(gòu)型的諸多參數(shù)中，DNA二級結(jié)構(gòu)中大溝、小溝的寬度和深度參數(shù)對DNA－蛋白質(zhì)、DNA－小分子結(jié)合有重要影響，如果這些參數(shù)改變，蛋白質(zhì)或小分子的識別及與DNA結(jié)合的強(qiáng)度都會發(fā)生變化[10]。

2.5mC表觀遺傳修飾標(biāo)記的優(yōu)越性

2.1 生命活動的能量

BER通路是在原核生物中就已經(jīng)存在的DNA修復(fù)機(jī)制，用于修復(fù)由于水解脫嘌呤、胞嘧啶及其衍生物的脫氨、鳥嘌呤的氧化、胞嘧啶和腺嘌呤特定位點(diǎn)上的甲基化等造成的單個堿基損傷[11]。然而在高等真核生物的基因表達(dá)調(diào)控中，這種修復(fù)機(jī)制卻被賦予了新的含義。可以看到以上所提的兩種已經(jīng)被證實(shí)的去甲基化途徑中，均利用了這種堿基配對修復(fù)機(jī)制來實(shí)現(xiàn)甲基化與去甲基化之間的動態(tài)變化。這種運(yùn)用已存在的通路實(shí)現(xiàn)新的生物學(xué)功能，拓展原有通路的方式，能夠節(jié)約生物體進(jìn)行基本生命活動所需的能量。例如，如果細(xì)胞要建立一個主動去甲基化的新通路，假設(shè)原有通路的蛋白及其他小分子對新通路沒有任何作用，那么新通路需要生物體合成全新的蛋白質(zhì)和小分子，效率明顯不如拓展原有通路高。

就5-甲基胞嘧啶而言，進(jìn)一步脫氨或氧化均可以啟動BER通路，即可運(yùn)用已有的胸腺嘧啶-DNA糖苷酶切除甲基化的胞嘧啶，實(shí)現(xiàn)去甲基化。

2.2 對細(xì)胞正常穩(wěn)態(tài)的影響

相比于胞嘧啶脫氨基、鳥嘌呤氧化和發(fā)生在堿基其他不同位點(diǎn)的甲基化等化學(xué)修飾而言，5mC修飾的優(yōu)勢在于不影響DNA的一級結(jié)構(gòu)，主要通過影響二級結(jié)構(gòu)來影響基因表達(dá)，不影響堿基配對和DNA的穩(wěn)定性，不會對生物體造成明顯的危害。

前文中已提到，在CpG島上的DNA甲基化能夠改變?nèi)旧|(zhì)的構(gòu)型。甲基化通過改變DNA二級結(jié)構(gòu)中大溝、小溝的寬度和深度參數(shù)，影響蛋白質(zhì)或小分子的識別及與DNA結(jié)合的強(qiáng)度。同時，對C5-MeC…G的電子占據(jù)數(shù)和授受體作用的二級微擾能量E2進(jìn)行分析，可以看到，胞嘧啶5-C位甲基化沒有改變GC 堿基間的氫鍵授受體作用方式，對G…C堿基間的氫鍵結(jié)合沒有顯著影響，不影響堿基配對，故不會降低DNA的穩(wěn)定性。隨著去甲基化的進(jìn)行，這種對蛋白質(zhì)或小分子的影響隨之消除，具有高度的可逆性和無損傷性。

此外，如圖所示，胞嘧啶可以在亞硫酸根的介導(dǎo)下實(shí)現(xiàn)脫氨基，從而生成尿嘧啶，造成基因突變。研究表明，5mC具有抵抗各種亞硫酸氫根介導(dǎo)的脫氨基作用的能力，這一特性被用于檢測全基因組中5mC的存在[12]。

因此胞嘧啶的甲基化修對于遺傳信息的保存沒有影響，不影響堿基配對，不具有毒性，甚至能夠一定程度上抑制C→U的基因突變，是一種理想的表觀遺傳標(biāo)記。

特別需要提到的是，另一種化學(xué)修飾，6-甲基腺嘌呤，它在原核生物中是限制性修飾系統(tǒng)的重要標(biāo)記，使得自身DNA不和外源DNA一樣被降解，除此之外，6-甲基腺嘌呤還能起到重要的調(diào)控作用，具有成為新的表觀遺傳修飾的潛能[13]。

下面筆者總結(jié)了其他常見化學(xué)修飾對細(xì)胞的影響：

（1）如果把胞嘧啶脫氨基作用作為表觀遺傳標(biāo)記，則生成尿嘧啶，改變了遺傳信息，甚至不可稱作表觀遺傳修飾，不可行。

（2）如果把鳥嘌呤氧化作用作為表觀遺傳標(biāo)記，那么鳥嘌呤氧化生成的8-氧鳥嘌呤不僅能夠與腺嘌呤配對，導(dǎo)致復(fù)制后堿基序列出錯，不利于遺傳信息精確地傳遞，還具有毒性[14]，不適宜在機(jī)體內(nèi)作為表觀遺傳標(biāo)記以一定數(shù)量存在。

（3）N3-甲基腺嘌呤可以阻止DNA的正常復(fù)制；N1-甲基腺嘌呤和N3-甲基胞嘧啶會阻止堿基對的形成；O6-甲基鳥嘌呤和O4-甲基胸腺嘧啶可能引起基因突變[15]。以上修飾均對細(xì)胞具有很大的毒性。

以上這些修飾都是不適于作為表觀遺傳標(biāo)記的。綜上，5mC相比于其他修飾具有明顯的優(yōu)越性，筆者推測這也是5mC成為高等真核生物的主要表觀遺傳標(biāo)記的原因。

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