阿爾海默茨病模型大鼠ERK的變化及山茱萸多糖干預①

邵 嘉，劉子純，詹 項，王萬濤，王宇嬌，王景霞

(1.佳木斯大學材料學院，黑龍江 佳木斯 154007；2.佳木斯大學基礎醫學院，黑龍江 佳木斯 154007)

阿爾海默茨病模型大鼠ERK的變化及山茱萸多糖干預①

邵 嘉1，劉子純2，詹 項2，王萬濤2，王宇嬌2，王景霞2

(1.佳木斯大學材料學院，黑龍江 佳木斯 154007；2.佳木斯大學基礎醫學院，黑龍江 佳木斯 154007)

目的：觀察絲山茱萸對AD大鼠學習記憶功能的影響。方法：清潔級Wistar大鼠共75只；體重200～250g，隨機分為6組：(1)假手術組，10只；(2)青年組，13只；(3)Aβ對照組，13只；(4)陽性對照組，13只；(5)水煎劑組，13只；(6)多糖組，13只；標準統一喂養，飲水自由。除青年組外，其他各組大鼠連續42d腹腔注射D-半乳糖(60mg/kg )，之后建立AD大鼠模型，采用淀粉樣蛋白1-40(Bamyloid,1-40) 海馬立體定向微量注射方法；通過HE染色、erk的檢測，觀察大鼠海馬CA1 、CA3區神經元的變化。結果：青年組大鼠海馬區錐體細胞排列緊密均勻，輪廓清楚，細胞核大而圓，胞漿清亮；假手術組大鼠海馬細胞排列尚緊密、欠均勻，輪廓尚清；而Aβ對照組細胞排列松散、紊亂，胞體可見明顯萎縮，可見細胞空泡樣變、核固縮；陽性對照組、多糖組和水煎劑組細胞排列、細胞密度、核著色和細胞核形狀等較Aβ對照組有所改善。ERK染色結果：模型組與正常對照組和假手術組比較，CA1和CA3區陽性細胞率明顯下降，有統計學意義(P<0.01)。山茱萸多糖、水煎劑及多奈哌齊組與模型組比較， CA1和CA3區陽性細胞率升高(P<0.01), 多奈哌齊、山茱萸多糖及水煎劑組間比較差異無統計學意義(P>0.05)。結論：本實驗以Aβ毒性學說為切入點，采用海馬注射Aβ1-40制作大鼠AD模型，探討山茱萸對AD的治療作用及ERK的變化，為臨床應用山茱萸治療AD提供實驗依據。

阿爾海默茨病；大鼠；山茱萸多糖；ERK

老年性癡呆(Alzheimer’s disease，AD)是以智力減退、行為損害為主要特征的臨床綜合征，發病緩慢，呈進行性加重，發病率隨年齡增高[1]。主要病理特征是老年斑神經元纖維纏結、海馬錐體細胞變性和神經元數量減少。老年斑的主要成分是Aβ，高濃度Aβ對神經元有毒性作用，Aβ沉積引起AD腦膽堿能神經元減少，Aβ沉積范圍與神經損傷和認知功能缺損有直接相關性。神經纖維纏結以成對螺旋絲樣結構存在，患者癡呆的程度伴隨神經纖維纏結的數量的增加逐漸加重[2]。上述病理性改變發生在與學習記憶以及認知有關的皮質、海馬等膽堿能系統。山茱萸主要具有免疫調節、降血糖、抗氧化及抗癌等作用，且毒副作用小，與治療AD的藥物多奈呱齊在提高AD患者操作性總有效率方面，差異無顯著性[3]。本實驗以Aβ毒性學說為切入點，采用海馬注射Aβ1-40制作大鼠AD模型，探討山茱萸對AD的治療作用及機制，為臨床應用山茱萸治療AD提供實驗依據。

1 實驗動物和藥品

清潔級Wistar大鼠75只，購自大連醫科大學動物實驗中心，體重200～250g，隨機分為6組：(1)假手術組，10只；(2)青年組，13只；(3)Aβ對照組，13只；(4)陽性對照組，13只；(5)水煎劑組，13只；(6)多糖組，13只；標準統一喂養，飲水自由。除青年組外，其他各組大鼠連續42d腹腔注射D-半乳糖(60mg/kg )，這后進行手術。術前進行水迷宮檢測，10%的水合氯醛腹腔注射進行麻醉(380mg/kg)，將大鼠固定在腦立體定位儀上，前囟后3.8mm，中線右側2mm，進針至距腦表面3mm，2min內緩慢注射，2μL生理鹽水注射與假手術組大鼠，其余各組(青年組除外)大鼠注射Aβ1-40(10μg·μL-1) 2μL，留針10min后，緩慢拔出，縫合切口，低溫環境下大鼠蘇醒。連續經胃灌服給藥30d，于最后一次給藥后次日，行水迷宮檢測。

2 標本采集

2.1 組織病理學觀察

大鼠乙醚麻醉、主動脈插管、生理鹽水灌洗、 10%多聚甲醛灌注約30min、組織變白，位于前囟后4mm處取腦組織，常規固定、脫水、透明、石蠟包埋，切片厚5μm，常規脫蠟入水，備用。

2.2 erk表達的檢測

將石蠟切片脫蠟入水，滴加3%H2O2室溫孵育10min，蒸餾水洗2min·(次×3)-1，微波熱修復抗原20min，PBS洗2min·(次)-1×3，滴加山羊血清封閉液37℃孵育20min，甩去多余血清，加erk抗體，置于濕盒中4℃過夜，PBS洗5min·(次)-1×3，滴加生物素化Ⅱ抗，水洗5min·(次)-1×3；滴加SABC37℃孵育30min，加DAB顯色3min，阻斷后蘇木素復染，脫水中性樹脂封片。觀察大鼠海馬CA1、CA3區40×檢測陽性細胞數。

2.3 統計學方法

3 結果

3.1 大鼠海馬區一般病理學變化

見圖1～2，青年組大鼠海馬區錐體細胞排列均勻，輪廓清晰整齊，胞漿亮，核大核仁明顯；假手術組大鼠海馬細胞排列尚緊密、欠均勻，輪廓尚清；而Aβ對照組細胞排列松散、紊亂，胞體可見明顯萎縮， 可見細胞空泡樣變、核固縮；陽性對照組、多糖組和水煎劑組細胞排列、細胞密度、核著色和細胞核形狀等較Aβ對照組有所改善。

圖1 大鼠海馬CA1區一般形態變化(400×)

圖2 大鼠海馬CA3區一般形態變化(400×)

3.2 海馬CA1區、海馬CA3 區ERK檢測結果

見表1。

表1 各組海馬CA1區、海馬CA3 區ERK陽性細胞

由表1可見模型組：與青年組和假手術組相比，ERK陽性細胞率明顯減少，有明顯的統計學差異(P<0.01)。山茱萸水煎劑組、山茱萸多糖組、多奈哌齊組：與模型組相比，ERK陽性細胞率增加，有明顯的統計學意義(P<0.01)，三個用藥組無統計學意義(P>0.05) 。

4 討論

阿爾茨海默病(AD)是一種病因和發病機制尚未完全明了且常見的中樞神經系統變性疾病。國內外學者研制很多種AD動物模型，符合其臨床和病理特點，為AD的研究奠定了基礎。大鼠基底核膽堿能神經元，發出投射纖維到海馬，扣帶皮質和大腦半球，包括額葉、頂葉和顳葉等廣泛區域，與學習記憶過程有關。Aβ通過毒性作用使中樞膽堿能神經元變性壞死，上行投射纖維變性，位于海馬及大腦皮質神經元膽堿能支配丟失，導致損害發生，膽堿攝取能力及釋放減少，膽堿能系統退化，活性下降、基底前腦膽堿能神經元嚴重丟失，導致 AD 患者進行性記憶障礙[4～6]。由此可見，Aβ在 AD 的發病過程發揮核心作用，通過直接引發細胞凋亡發生。實驗結果顯示:海馬內注射Aβ1-40的模型組大鼠HE染色可見海馬區神經元不規則排列，數量減少，可見錐體細胞大量壞死，海馬內注射Aβ1-40建立的AD模型大鼠符合神經元丟失等病理學改變，可靠且有實用意義。青年組大鼠海馬區可見排列緊密均勻，輪廓清楚的椎體細胞，胞漿清亮；假手術組大鼠海馬細胞排列尚緊密、欠均勻，輪廓尚清；而Aβ對照組細胞排列松散、紊亂，胞體可見明顯萎縮，可見細胞空泡樣變、核固縮；陽性對照組、多糖組和水煎劑組細胞排列、細胞密度、核著色和細胞核形狀等較Aβ對照組有所改善。ERK信號通路是目前研究較活躍的信號轉導通路，ERK參與調控細胞的增殖分化、凋亡，神經的損傷與修復等過程，腦內神經元長時程增強的形成[7～10]以及認知學習功能與ERK密切相關[8～10]山茱萸可能通過激活ERK途徑，作用機制可能是ERK1/2磷酸化水平增高，可以調節樹突蛋白合成，影響與LTP以及神經突觸可塑性相關的核轉錄因子和蛋白質翻譯起始因子的磷酸化狀態，提高AD大鼠學習記憶能力, 山茱萸多糖改善AD大鼠學習記憶能力通過激活ERK途徑實現的。

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1.黑龍江省大學生創新創業訓練計劃項目，編號：201610222031；2.黑龍江省教育廳科研項目,編號：12541791。

邵嘉(1997～)女，黑龍江佳木斯人,在讀本科生。

王景霞(1964～)女，黑龍江佳木斯人，碩士，教授，碩士研究生導師。E-mail:wangjingxia1964@163.com。

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