Balb/c3T3細胞轉化電化學試驗方法的研究①

朱金玲，武冬梅，李錦蓮，王景濤

(1.佳木斯大學基礎醫學院，黑龍江 佳木斯 154007； 2.佳木斯大學藥學院，黑龍江 佳木斯 154007)

Balb/c3T3細胞轉化電化學試驗方法的研究①

朱金玲1，武冬梅2，李錦蓮2，王景濤1

(1.佳木斯大學基礎醫學院，黑龍江 佳木斯 154007； 2.佳木斯大學藥學院，黑龍江 佳木斯 154007)

目的：利用伏安行為的電化學方法研究Balb/c3T3細胞轉化過程中嘌呤核苷酸代謝變化規律，確定細胞轉化的電化學檢測指標。方法：利用MNNG與TPA誘導Balb/c3T3細胞體外進行轉化，同時利用ITEs進一步加速轉化效率，在不同時間點對轉化的細胞進行細胞形態學觀察、軟瓊脂克隆實驗及伏安行為電化學檢測，電化學法跟蹤BALB/c3T3細胞轉化過程中嘌呤含量的變化。結果：實驗第10天開始，轉化細胞的嘌呤的信號峰值明顯高于對照組(DMSO組)，細胞內嘌呤含量增多，同時細胞增殖加速。ITEs可縮短轉化時間。結論： 嘌呤可作為電化學法檢測的生物標記物，伏安行為的的電化學法可以快速檢測體外細胞發生惡性轉化的過程，與傳統方法相比，縮短了檢測周期，有望成為一種簡單、快速、靈敏、低成本的細胞轉化檢測新手段。

細胞電化學；Balb/c3T3細胞；細胞轉化

國際癌癥中心指出，80%～90%的人類腫瘤是由環境致癌物引起的，目前有效的篩選和檢測環境污染物的方法，主要包括Ames 致突變試驗、染色體畸變試驗、微核試驗、單細胞凝膠電泳技術(即彗星試驗)、體外細胞轉化試驗等，其中體外哺乳動物細胞轉化試驗被認為是一種有效的篩選致癌物的方法[1]。但該實驗的檢測終點是通過細胞形態的變化決定的，檢測時間較長且結果主觀性強。因此建立新的細胞轉化檢測的方法成為急需解決的問題。

細胞電化學[2,3]是當代生物技術與微電子技術、化學、分子細胞生物學等多學科結合的產物。近年來,人們開始注意活細胞的電化學識別與檢測, 鞠熀先[2]等提出完整細胞伏安信號來源于細胞內鳥嘌呤快速通過細胞膜后在電極表面發生的氧化反應，使用細胞內嘌呤電化學信號能夠從核苷酸代謝角度反映細胞活性。本課題組研究了活細胞電化學響應機理，發現完整細胞的電化學信號來源于細胞外分泌物中鳥嘌呤和黃嘌呤的氧化反應，細胞裂解后得到的細胞質伏安信號遠高于完整細胞，并能更客觀地反映細胞的活性[4～6]。細胞體外轉化過程中，DNA復制增加，細胞增殖速度劇增，核苷酸代謝旺盛，導致嘌呤堿基相對含量異常增高。所以本實驗利用伏安行為的電化學法對Bal/c3T3細胞轉化過程進行跟蹤監測，探討體外細胞轉化過程中嘌呤核苷酸代謝變化規律，確定細胞轉化的電化學檢測指標。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗細胞

小鼠胚胎成纖維細胞BALB/c3T3 clone A31，購自中國科學院上海生命科學研究院細胞資源中心。

1.1.2 主要試劑

DMEM培養基、胎牛血清為GIBCO公司產品；葡萄糖、HEPES為天津市科密歐化學試劑有限公司產品;N-甲基-N.-硝基-N-亞硝基胍(N-methy-lN-nitro-N-n itrosoguan id ine, MNNG)、佛波酯( 12-O-tetradecanoy-l phorbo-l 13-ace tate, TPA)、DMSO、 ITEs(牛胰島素500μg/mL、轉鐵蛋白1000μg/mL、乙醇胺153μg/mL和亞硒酸鈉0.43μg/mL),Sigma公司；低熔點瓊脂糖，Solarbio公司。

CHI615E 電化學工作站為上海辰華儀器有限公司產品；3mm玻碳電極為上海辰華儀器有限公司產品；多壁碳納米管多壁碳納米管(MWNT)10～20nm為深圳納米港有限公司產品；YCP-200 CO2細胞培養箱為上海易亮醫療器械有限公司產品；YJ-875SDB超凈工作臺為哈爾濱藍皓空氣凈化設備有限公司產品。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養

將BALB/c3T3細胞培養于含有10 %的胎牛血清和1%青霉素-鏈酶素雙抗的DMEM完全培養基中，在37℃、5% CO2條件下進行培養。待對數生長期，用胰酶消化0.5min，調節所要細胞濃度傳代并進行分組，然后進行細胞轉化和電化學試驗。

1.2.2 細胞轉化實驗

常規轉化組：實驗分為4組，第1組是MNNG+TPA處理組:將細胞以1×104/皿接種于直徑為60mm平皿中，37℃，5% CO2濕箱中培養，DMEM培養基血清濃度為10%，培養24h后加入MNNG 1μg/mL，4h后換培養基除去MNNG，繼續培養7d，于接種后第8天加入濃度為0.1μg /mL的 TPA繼續培養，每周換液2次，同時補加TPA，第22天除去TPA，第27天甲醇固定細胞, 10%的Giemsa染液染色，觀察細胞形態及轉化灶。第2組是MNNG+DMSO組：用0.2%的DMSO代替TPA，第3組是DMSO對照組：用DMSO代替MNNG和TPA，第4組是正常完全培養基組:不加任何藥品。其他方法同TPA處理組。實驗第1、3、7、10、14、17、21天，分別取出2皿細胞，進行細胞計數和電化學檢測。

改良培養基轉化組：按常規轉化組(4組)處理的細胞在第8天添加TPA的同時加入改良的DMEM培養基，其中含有1%ITEs和含2%的胎牛血清，且第14天除去TPA, 第19天甲醇固定細胞，10%的Giemsa染液染色，觀察細胞形態及轉化灶。實驗第1、3、7、10、14、17、21天，分別取出2皿細胞，進行細胞計數和電化學檢測。

1.2.3 形態學觀察及計數

對以上8組細胞培養結束時，利用倒置顯微鏡進行形態學觀察，取對數生長期細胞，用0.25%胰蛋白酶消化并輕輕吹打，使之成為單細胞，作活細胞計數。

1.2.4 轉化結果判定方法

值得說明的是,關于為什么上述斜向垂直環流圈在某一時段能夠形成而在另一時段不能形成的原因則還需進一步探索。

體外細胞轉化試驗是以細胞形態惡性轉化為檢測終點。對轉化細胞的判定通常采用細胞灶法，計數克隆數，觀察鑒定轉化灶，單盲法觀察，由2人共同認定。轉化灶的判定標準:正常細胞灶,灶內細胞排列規則,束狀,細胞灶外圍區的細胞單層生長,規則。轉化細胞灶,灶內細胞由正常的長梭形變為短梭狀,失去接觸抑制,呈復層生長,排列紊亂,形成交叉和旋渦。吉姆薩染色惡性轉化灶細胞嗜堿深染，致密多層，自由定向生長。

1.2.5 軟瓊脂集落實驗

分別制備1.2%和0.7%兩個濃度的低溶點瓊脂糖液，高壓滅菌，按1:1比例使1.2%的瓊脂糖和2×DMEM培養基(含有2×抗生素和20%的小牛血清)混合后，取3mL混合液注入60mm平皿中，冷卻凝固，作底層瓊脂放入溫箱中備用。同樣方法將0.7%的瓊脂糖和2×DMEM培養基按1:1比例混勻，注入0.2mL的細胞懸液，充分混勻，注入鋪有1.2%瓊脂糖的平皿中，形成雙瓊脂層。待上層瓊脂凝固后，置入37℃ 5%CO2溫箱中培養10～14d。取出平皿放置在倒置顯微鏡下，觀察細胞克隆數。計算形成率。

1.2.6 細胞轉化的電化學檢測

1.2.6.1 細胞樣品的制備

實驗組細胞棄掉培養液，并加入450μL體積的pH=7.4的PBS緩沖溶液。用封口膜封好皿口以防止水浴鍋中的水倒灌入培養皿中，并將其置于50℃水浴鍋中加熱30min，回收液體進行電化學檢測。

1.2.6.2 電極的制備及電化學檢測

電極制備參考劉慧東的方法[7]。采用三電極體系: MWNTs/GCE為工作電極,Ag/Agcl為參比電極,鉑絲電極為對電極。CV掃描范圍為0.0～1.1V,掃描速率。

1.3 統計學方法

2 結果

2.1 細胞轉化的形態學吉姆薩染色結果

見圖1。

正常組(×100) ITES+正常組(×100)

如圖1所示，正常轉化組與改良培養基轉化組比較，ITES組總體轉化效率提高，轉化時間縮短，且加入ITES的MNNG-TPA組惡性程度極高。

2.2 軟瓊脂集落實驗結果

見表1。

表1 轉化的Balb/3T3細胞在軟瓊脂上的集落形成率

與空白對照組對比，*P<0.05。與空白對照組對比，**P<0.01。

2.3 伏安行為的電化學檢測結果

見圖2。經標準品的峰值相對比發現，各組所出現的氧化峰所在位置為是黃嘌呤和鳥嘌呤的氧化峰。圖2.A、B中幾乎沒有氧化峰出現，圖2.C個別組有低氧化峰，圖2D～G中可以發現每一個實驗組均有氧化峰出現在0.70～0.75V。且隨著時間的推進氧化峰的峰高有明顯的升高。其中TPA+MNNG組與空白對照組，ITES+TPA+MNNG與ITES組對比峰高存在明顯的差異。而加入ITES的改良組與常規轉化組相比較，在第10天后存在差異。

3 討論

目前為止，環境致癌有兩個階段，暨啟動劑和促癌劑。促癌劑在人類環境中存在極為廣泛，通常認為啟動劑可以作為DNA 誘變劑，且促癌過程時間長、可逆。腫瘤的環境致癌因素眾多,目前得到廣大學者認同的是則是佛波酯轉化實驗[8]，但是由于方法存在很多不足，所以后期有大量的學者在此基礎之上進行改進。有研究表明伏安行為的電化學信號的來源，并對其進行電化學活性成分的分析。嘌呤堿的含量與細胞的增殖能力呈正比，所以也就可以說嘌呤堿的變化可以反映細胞的增殖情況[2，9，10]。為此我們探討應用電化學方法跟蹤檢測Balb/c3T3細胞轉化過程中嘌呤含量的變化。 同時應用ITEs改良培養基，縮短轉化時間。我們的實驗結果顯示細胞發生癌變時細胞的內的鳥嘌呤和黃嘌呤的峰值發生升高。實驗第10天開始，轉化細胞的嘌呤的信號峰值明顯高于對照組(DMSO組)，細胞內嘌呤含量增多，同時細胞增殖加速，此實驗結果說明以嘌呤為生物標記物，伏安行為的電化學法可以快速檢測體外細胞發生惡性轉化的過程，與傳統方法相比，該方法縮短了檢測周期， 簡單、快速、靈敏、成本低，有望成為細胞轉化檢測新手段。

圖2 A、B、C、D 、E、F、G分別為第1、3、7、10、14、17、21天的各實驗組BALB/3T3細胞內的嘌呤堿的變化

[1]張磊,曾毅.Balb/c 3T3細胞體外轉化實驗及其在環境致癌物檢測上的應用[J].衛生研究,2009,38(2):226-232

[2]鞠熀先. 電分析化學與生物傳感器[M]. 北京：北京科學出版社, 2006：377-378

[3]Xueen Jia, Liang Tan, Ya-ping Zhou, et al. Magnetic immobilization and electrochemical detection of leukemia K562 cells[J].Electrochemistry Communications, 2009, 11:141-144

[4]劉慧東,李彥儀,蔡雨，等.BALB/3T3細胞電化學行為的研究[J].黑龍江醫藥科學,2015,38(6)：29

[5]王倩，張靜，張麗茹，等.MCF-7 細胞核的電化學行為研究[J].黑龍江醫藥科學, 2016，39(4):147-150

[6]劉冰，焦宇，王思君，等.高分化PC12 細胞電化學行為研究[J].黑龍江醫藥科學, 2016， 39(4):103-104

[7]劉慧東，李彥儀，蔡雨，等.BALB /3T3 細胞電化學行為的研究[J].黑龍江醫藥科學,2015， 38(6):29-30

[8]Rodríguez-Sastre, Emilio Rojas, Valverde Mahara. Assessing the impact of As-Cd-Pb metal mixtu- re on cell transformation by two-stage BALB/c 3T3 cell assay[J].Mutagenesis, 2014, 29(4):251-257

[9]張京京，王斌，賈文麗，等.碳納米管修飾電極研究鳥嘌呤及其核苷酸電化學行為及測定[J].化學傳感器,2007，27(2):57-62

[10]李遠,張晶,廖娟，等.基于氧化石墨烯/聚吡咯-銦錫氧化物微電極的細胞阻抗生物傳感器構建及細胞黏附增殖行為檢測[J].傳感技術學報,2016; 29(6)：787-796

StudyonelectrochemicaltestmethodforBalb/c3T3cellstransformation

ZHUJin-ling1,WUDong-mei2,LIJin-lian2,WANGJing-tao1

(1.Basic Medical College of Jiamusi University，Jiamusi 154007,China;2.Pharmaceutical College of Jiamusi University,Jiamusi 154007,China)

Objective: To study the metabolism variation regularity of purine nucleotide and ensure the electrochemical biomarkers during the process of Balb/c3T3 cells transformation by using electrochemical detection methods.MethodsMNNG and TPA were used to induce the transformation of Balb/c3T3 cells in vitro. The transformation efficiency was further accelerated by ITEs. At different time, the transformed cells were observed by cell morphological and soft agar cloning methods. The changes of purine level in BALB/c3T3 cells were detected by electrochemical method.ResultsFrom the 10th day of the experiment, the peak value of purine signal began significantly higher than that of the control group (DMSO group). The intracellular purine content began to increase, cell proliferation rate was accelerated, and conversion time was shortened by ITEs.ConclusionsPurine can be used as biomarker of electrochemical detection; Voltammetric behavior of the electrochemical method can quickly detect the malignant transformational process of cells in vitro; Compared with the traditional method, voltammetric behavior of electrochemical method shortened the detection period, and was expected to become a simple, sensitive, low-cost new method for cell transformation test.

cell electrochemistry; Balb/c3T3 cells;cell transformation

1.黑龍江省自然科學基金項目，編號：H201369；2.佳木斯大學創新團隊項目，編號：CXTDPY-201602。

朱金玲(1967～)女，黑龍江佳木斯人，碩士，教授，碩士研究生導師。

Q813

A

1008-0104(2017)06-0016-03

2017-04-18)