鹽脅迫下沙棗生物固氮能力及氮素分配研究

魏 琦，武海雯，劉正祥*，李煥勇，楊秀艷，張華新

(1. 北京市林業工作總站，北京 100029； 2. 國家林業局鹽堿地研究中心，北京 100091)

鹽脅迫下沙棗生物固氮能力及氮素分配研究

魏 琦1,2，武海雯2，劉正祥2*，李煥勇2，楊秀艷2，張華新2

(1. 北京市林業工作總站，北京 100029； 2. 國家林業局鹽堿地研究中心，北京 100091)

目的應用15N自然豐度法研究鹽脅迫條件下沙棗的生物固氮能力，并探討幾個耐鹽樹種的氮素分配情況。方法通過耐鹽樹種的室內砂培試驗，確定鹽漬生境條件下以空氣氮為唯一氮源的沙棗15N相對豐度B值及其適宜的參比植物；估測室內和野外鹽漬生境中沙棗的生物固氮能力；并通過測定碳、氮、磷元素含量探討了幾種耐鹽樹種的氮素分配情況。結果室內鹽脅迫砂培試驗條件下，沙棗的B值為-1.41‰；檉柳和白蠟可作為沙棗的參比植物；沙棗的生物固氮百分率為55.03%。野外中度鹽漬環境中，沙棗生物固氮百分率為69.69%。試驗條件下，沙棗、檉柳和白蠟3個耐鹽樹種中，沙棗植株及其葉、莖、根含氮量最高，且與其它樹種差異顯著(P<0.05)；沙棗植株氮/碳含量比以及氮/磷含量比最高；沙棗葉、莖和根的氮/磷含量比最高。野外中度鹽漬環境中，沙棗葉的氮/碳含量比以及氮/磷含量比均為最高。結論15N自然豐度法可用于研究鹽脅迫條件下沙棗的生物固氮能力，檉柳和白蠟可作為參比植物；沙棗在鹽脅迫下的固氮能力較強，是可應用于鹽漬土生物改良的優良樹種。本文為鹽脅迫條件下利用15N自然豐度法研究生物固氮作用提供方法參考，對于鹽堿地生物治理中植物材料的選擇和耐鹽樹種資源的綜合開發利用具有重要意義。

鹽脅迫；沙棗；生物固氮；耐鹽樹種

土地鹽漬化是一個世界性的生態和資源難題，據統計，全世界鹽堿地面積超過8×106km2[1]。我國鹽漬土分布廣泛，各種不同類型的鹽堿土壤約占國土總面積的10.3%，其面積約為1×106km2[2]，主要集中在華北的黃淮海地區、東北的三江平原和西北地區的大部等干旱、半干旱地區。鹽漬土作為重要的土地后備資源，亟待治理、開發和利用。通過生物措施改良鹽漬土，既有生態效益，又有經濟效益和社會效益，是治理、開發和利用鹽漬土的重要途徑，已為很多國家和地區接受和采用[3-5]。種植耐鹽固氮樹種是進行生物改良鹽漬土的有效方法之一。耐鹽樹種可以在一定的鹽脅迫下正常生長，又可以通過生物固氮提供自身生長所需的氮素，還可以改善土壤養分狀況，有利于其它植物及微生物的生存、生長，進而促進土壤物理性狀的改善，促進營建一定的植物群落。耐鹽固氮樹種生物固氮作用的研究也越來越受到關注。

沙棗(ElaeagnusangustifoliaL.)為胡頹子科(Elaeagnaceae)胡頹子屬(ElaeagnusL.)落葉喬木或小喬木[6]，別名桂香柳、香柳、銀柳，是我國北方生態脆弱地區分布較廣的重要固氮鹽土植物。沙棗根系可以與弗蘭克氏菌共生形成根瘤共生體系，是木本非豆科放線菌共生固氮樹種。弗蘭克氏菌Frankiasp.(Hippophae)是一種共生固氮放線菌，能夠侵染沙棗、沙棘等多種非豆科樹種并能在其根部形成根瘤，其固定的氮可供給宿主植物需要，也是陸地生態系統中輸入氮源的主要貢獻者。

沙棗主要分布于地中海沿岸、亞洲西部、前蘇聯和印度等地，在我國主要分布在廣大的西北各省區和內蒙古西部，少量分布于華北北部、東北西部，大致在北緯34°以北地區，山東、河北、天津、山西等省區也有引種栽培。沙棗具有抗風沙、耐鹽漬、耐高溫、耐貧瘠、易繁殖、適應性強等特點，是我國北方生態脆弱地區造林綠化、防風固沙的先鋒樹種，是鹽堿地造林及改造干旱、沙地、荒地的優良樹種之一[7-8]。沙棗作為飼料已有悠久的歷史，還有釀酒、制蜜等食用用途，其花、果、枝、葉又可入藥治療燒傷、支氣管炎、消化不良、神經衰弱等。沙棗是優良的造林、綠化、薪炭、防風、固沙樹種，具有良好的生態、經濟、食用和藥用價值。

近年來，15N自然豐度法已逐漸成為一種應用范圍較廣的定量研究生物固氮的方法，在國際上日益受到重視，已廣泛應用于陸地生態系統的氮循環研究中[21]。使用15N自然豐度法具有以下優勢：不需要采集根瘤，不需要15N標記物，不干擾野外植物和土壤生態系統，不受取樣時間和空間的限制[22-24]，并且測量簡單[25]。測定15N豐度即可估測固氮情況，可用于多年生木本固氮植物固氮能力的評估是其不可替代的優點[26- 27]。綜合目前固氮測定技術的優缺點及應用范圍等，對于研究多年生木本固氮樹種，15N自然豐度法是較佳的選擇[28]。

研究耐鹽固氮樹種鹽脅迫下生物固氮機理對于鹽堿地生物改良中植物材料的選擇和綜合開發利用具有重要意義。目前在鹽漬土條件下利用15N自然豐度法評價耐鹽固氮樹種固氮能力的研究較匱乏，林用耐鹽固氮樹種生物固氮方面系統、深入的研究較少。本研究通過耐鹽樹種的室內砂培試驗，對15N自然豐度法在鹽脅迫下的應用條件進行優化，確定鹽漬土條件下適宜的參比植物；估測室內及野外環境中沙棗的生物固氮能力；并探討了幾種耐鹽樹種的氮素分配情況。本研究可以為鹽漬土條件下應用15N自然豐度法研究耐鹽樹種生物固氮作用提供參考，為耐鹽固氮樹種資源綜合開發利用提供理論基礎。

1 材料與方法

1.1 室內砂培試驗

B值是以空氣氮為唯一氮源的固氮植物的15N相對豐度值，是植物僅通過自身固氮得到的那部分氮素。木本植物與草本植物、谷類等農作物之間具有一定的生物學差異，因此選擇前人研究的草本植物作為參比植物可能不適合木本植物的研究。B值及參比植物對于應用15N自然豐度法估算生物固氮量有著重要的意義。

本研究通過沙棗不供給氮源的室內砂培試驗，獲得沙棗鹽脅迫條件下應用15N自然豐度法時的B值。由于沒有現成的參比植物，因此對于適應于重度鹽度環境中的固氮植物沙棗，選取適應于中、重度鹽度環境的白蠟、檉柳2種鹽堿地常見非固氮植物作為備選參比植物，這些植物具有較好的抗性，耐旱、耐鹽堿，根系較發達，與研究的耐鹽固氮植物特性相近。

1.1.1 培養方法及條件 營養缽選用上口徑27 cm、下口徑17 cm、高22 cm的聚乙烯塑料盆，用無紡布將盆底排水孔覆蓋防止營養液過分流失。每盆中加入等量的河砂基質(4.5 kg±50 g)。選用沙棗、檉柳(TamarixchinensisLour.)、白蠟(FraxinuschinensisRoxb.)1年生溫室培養實生苗。小苗移植入盆，每盆植入1株植株，視基質濕度情況，每7 d左右澆一次水，澆透盆。緩苗20 d，之后選取長勢基本一致的健康植株進行試驗。試驗處理中鹽脅迫設置1個處理水平，NaCl濃度為100 mmol·L-1，處理溶液為相應質量的NaCl溶入營養液配制而成。試驗處理見表1，每處理6個重復。試驗中需要無氮營養液和有氮素營養液[29-30]。無氮營養液組成見表2，有氮素營養液是在無氮營養液的基礎上加入含氮化合物，加入的成分見表3。試驗所用藥品均為分析純。鹽脅迫當天開始，參試植物沙棗(處理1)及參比植物檉柳、白蠟(處理2、3)添加含鹽有氮素營養液。測B值的沙棗(處理4)添加含鹽無氮營養液。首次澆灌含鹽營養液時澆透盆，之后視基質濕度情況，每7 d左右澆灌1次，每盆澆灌等量含鹽營養液。

表1 試驗設計

1.1.2 測定項目及方法 首次鹽脅迫處理記為0 d，之后第30 d時，取樣測定。

(1)葉中15N豐度值。

取各處理植株各枝條上嫩葉，各重復混合后，105℃下殺青10 min，80℃下烘干48 h，粉碎過0.25 mm篩，樣品混合均勻，Flash EA1112 HT元素分析儀及DELTA V Advantage同位素比率質譜儀(美國Thermo Fisher Scientific公司)分別測定15N原子豐度。樣品15N相對豐度：

表2無氮營養液成分組成

Table2Compositionofnitrogen-freenutrientsolution

化合物Compound質量濃度Concentration/(mg·L-1)KH2PO422KCL155MgSO4·7H2O250CaCL2·2H2O215EDTANa218NaNO330MnSO4·H2O1ZnSO4·7H2O0．25H3BO30．25CuSO4·5H2O0．25Na2MoO4·2H2O0．05

表3營養液加入成分組成

Table3Compositionofnutrientsolutioncomplemented

化合物Compound質量濃度Concentration/(mg·L-1)Ca(NO3)2·4H2O472．5KNO3253NH4NO340

其中δ15N為樣品15N相對豐度，atom%15N(sample)為樣品15N原子豐度，atom%15N(standard)為大氣標準15N原子豐度(0.366 3%)。

(2)固氮植物的生物固氮貢獻。

其中%Ndfa表示植株體內來自大氣中的那部分氮，δ15Nref表示參比植物15N相對豐度值，δ15Nfixing-plant表示固氮植物15N相對豐度值，B值表示以空氣氮為唯一氮源的固氮植物的15N相對豐度值。

(3)葉面積、株高和生物量。

采用Yaxin-1241葉面積儀(北京雅欣理儀科技有限公司)測定上述植株樹葉樣品的葉面積。

測定上述參試植株株高，以植物根莖聯合處為起點到主莖頂端最高點的距離。

對參試植物沙棗、檉柳、白蠟(處理1-3)進行取樣，取根、莖、葉，在105℃下殺青1 h，80℃下烘干至恒質量，分別稱質量。

植株總生物量=根生物量+莖生物量+葉生物量

(4)植物的碳、氮和磷含量 植株含碳質量百分率由Vario EL III元素分析儀測定。

上述植株根、莖、葉樣品，用Vario EL III元素分析儀(德國Elementar公司)分別測定各器官含氮質量百分率。

植株氮的含量=根生物量×根含氮質量百分率+莖生物量×莖含氮質量百分率+葉生物量×葉含氮質量百分率

植株含磷的質量百分率通過H2SO4-H2O2消煮-鉬銻抗比色法測定。

(5)生長季生物固氮量和吸氮量。

植株生長季內的生物固氮量[31]=植株氮的含量×生物固氮百分率(%Ndfa)

植物生長季內的吸氮量=植株生物固氮量×固氮植物數量

1.2 野外沙棗生物固氮能力測定

試驗地點為天津市大港區濱海耐鹽堿植物示范園。土壤pH8.5，土壤含鹽量0.4%。以5年生耐鹽樹種沙棗、檉柳和1年生白蠟為研究對象，對沙棗、檉柳和白蠟當年生枝葉進行取樣，每棵樹均在各方向取樣，每樹種取6株重復，取樣時間為7月上旬。

各樹種樣品105℃下殺青10 min，80℃下烘干48 h，粉碎過0.25 mm篩，樣品混合均勻，穩定同位素質譜儀分別測定15N原子豐度。計算樣品15N相對豐度及沙棗的生物固氮百分率(%Ndfa)，計算方法同前述。

2 結果與分析

2.1 參比植物的選擇

2.1.1 室內砂培試驗根瘤情況 首次鹽脅迫處理后第30 d取樣，固氮植物沙棗生長情況及其根瘤見圖1。由圖可看出，沙棗莖、葉及根長勢良好，根須較密集，根上長有較多根瘤，滿足了本試驗中沙棗植株必須培養出根瘤以進行生物固氮的要求。

圖1 沙棗及其根瘤Fig.1 E. angustifolia and root nodules

2.1.2 B值及參比植物 通過砂培試驗測得的植物15N相對豐度(表4)。沙棗的B值為-1.41‰。

表4 15N相對豐度

以試驗測定的B值為參數，分別以檉柳、白蠟為參比植物計算鹽脅迫下沙棗生物固氮百分率結果見表5。由表5可知，以檉柳、白蠟為參比植物估測的沙棗生物固氮百分率分別為57.41%和52.65%，相差為4.76%。當計算得到的%Ndfa小于30%，或者參比植物的δ15N值小于4‰時；當%Ndfa大于70%，或者參比植物的δ15N值大于6‰時，參比植物的影響可以忽略[32-33]。由表4看出，試驗參比植物的δ15N值均小于4‰。因此在試驗條件下，應用15N自然豐度法估測沙棗的生物固氮能力時，檉柳和白蠟均可作為參比植物。

表5 生物固氮百分率

2.2 鹽脅迫下沙棗生物固氮能力

2.2.1 室內鹽脅迫下沙棗生物固氮量 溫室砂培條件下，以2.1.2測得的沙棗B值為參數，以檉柳和白蠟為參比植物測定沙棗的生物固氮百分率%Ndfa，取表5中測定的均值55.03%，結合生物量、含氮量等數據，測定沙棗的生物固氮量。

實驗結果得出，沙棗單株植株在試驗生長季內的生物固氮量平均為0.30 g。砂培試驗處理1的所有沙棗植株在試驗生長季內的總吸氮量為1.80 g。

2.2.2 野外中度鹽度下沙棗生物固氮能力 以砂培試驗測定的沙棗B值為參數，以檉柳、白蠟為參比植物，對野外中度鹽漬環境中的沙棗進行生物固氮能力測定，見表6。由表可知，以檉柳、白蠟為參比植物測得的沙棗生物固氮百分率分別為67.36%和72.01%，相差4.65%，平均生物固氮百分率為69.69%。

表6 沙棗生物固氮百分率

2.3 鹽脅迫下耐鹽樹種氮素分配

表7 耐鹽樹種生長指標

注：數值=平均值±標準誤(n=6)，采用鄧肯氏新復極差檢驗法(DMRT法)進行多重比較，行中相同字母表示差異不顯著，檢驗的顯著性水平為P=0.05。Note：Values are mean ± S.E. (n=6). Values in a low followed by same letters are not significantly different (p=0.05) according to duncan’s multiple comparison (DMRT).

表8 參試樹種氮素分配

注：數值=平均值±標準誤(n=6)，采用鄧肯氏新復極差檢驗法(DMRT法)進行多重比較，行中相同字母表示差異不顯著，檢驗的顯著性水平為P=0.05。

Note：Values are mean ± S.E. (n=6). Values in a low followed by same letters are not significantly different (p=0.05) according to duncan’s multiple comparison (DMRT).

表9 耐鹽樹種碳、氮、磷含量比

表10 野外耐鹽樹種葉碳、氮、磷含量比

3 討論

15N自然豐度法在生物固氮研究中的應用、豆科植物生物固氮以及植物鹽脅迫下的耐鹽性等研究已較成熟[34-35]，但目前15N自然豐度法應用于鹽脅迫條件下的研究資料還較少，尤其是應用于鹽漬土條件下評價林用耐鹽木本非豆科放線菌共生固氮樹種固氮能力的研究較匱乏。15N自然豐度法具有方便簡單等很多優勢，本文以木本非豆科放線菌共生固氮樹種沙棗為研究對象，對15N自然豐度法在鹽脅迫條件下的適用性進行了探索，可以為鹽脅迫條件下利用15N自然豐度法研究生物固氮作用提供計算參數和理論基礎。

確定B值及參比植物等15N自然豐度法的應用條件，使其能夠應用于鹽漬土壤條件下植物生物固氮能力的評估，是探討耐鹽固氮樹種對鹽堿地生物改良作用的基礎理論研究。沙棗等植物根系與弗蘭克氏菌共生形成根瘤共生體系，是非豆科放線菌共生固氮樹種；大部分豆科樹種根系與根瘤菌屬的細菌共生形成根瘤共生體系，是豆科根瘤菌共生固氮樹種。不同生物固氮機制類型的耐鹽樹種在不同鹽度脅迫條件下的生物固氮能力是否存在差異，其對不同鹽脅迫的響應如何；不同固氮類型的耐鹽樹種在鹽漬土條件下和非鹽脅迫條件下的生物固氮能力是否存在差異等等科學問題，還需要今后做進一步的系統研究和探討。除檉柳和白蠟外，沙棗適宜的參比植物還有哪些，其它生物固氮樹種或其他不同生物固氮類型的植物所適宜的參比植物如何選擇，需要后續的研究探討。

耐鹽固氮樹種是一類良好的生物改良鹽堿地的植物資源，在多種鹽脅迫水平或重度鹽度條件下，應用15N自然豐度法評價多種不同生物固氮類型的耐鹽固氮樹種的生物固氮能力還需要今后深入的研究探討。

4 結論

(1)溫室環境中，鹽脅迫下的室內砂培試驗表明，檉柳和白蠟可作為參比植物用于在試驗的鹽漬土壤條件下利用15N自然豐度法估算沙棗的固氮能力。試驗條件下，以空氣氮為唯一氮源的耐鹽固氮樹種沙棗的15N相對豐度值B值為-1.41‰。試驗的鹽脅迫條件下沙棗的生物固氮百分率為55.03%，野外土壤中度鹽漬環境中，沙棗生物固氮百分率為69.69%。

(2)參試植物中，沙棗植株及其葉、莖、根含氮量最高且與其它樹種差異顯著(P<0.05)；沙棗植株氮/碳含量比及氮/磷含量比最高；沙棗葉、莖及根的氮/磷含量比最高。野外中度鹽漬環境中沙棗葉的氮/碳含量比及氮/磷含量比均最高。

(3)試驗測定的沙棗生物固氮百分率均大于50%，沙棗植株及其葉、莖、根含氮量均較高，且室內及野外環境中沙棗植株氮/碳含量比及氮/磷含量比均較高，表明沙棗在鹽脅迫下的固氮能力較強，是可應用于鹽漬土生物改良的優良樹種。野外環境中測定的沙棗生物固氮百分率高于室內培養的，可能與土壤、大氣、水分、光照及溫濕度等環境條件以及植物生長時間、體內固氮酶等因素有關。

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BiologicalNitrogenFixationAbilityandNitrogenDistributionofElaeagnusangustifoliaunderSaltStress

WEIQi1,2,WUHai-wen2,LIUZheng-xiang2,LIHuan-yong2,YANGXiu-yan2,ZHANGHua-xin2

(1. General Forestry Station of Beijing Municipality, Beijing 100029, China; 2. Research Center of Saline and Alkali Land of State Forestry Administration, Beijing 100091, China)

ObjectiveTo estimate the biological nitrogen fixation ofElaeagnusangustifoliaunder salt stress and to study the nitrogen distributions of several saline-tolerant trees species.MethodSaline-tolerant trees were cultivated in greenhouse, and the value of15N natural abundance (B) and appropriate reference plants in saline habitat were determined; the biological nitrogen fixation abilities ofE.angustifoliain greenhouse and field saline habitat were investigated; and the nitrogen distributions of several saline-tolerant trees were obtained by determination of carbon, nitrogen and phosphorus contents.ResultThe results of planting trials showed that the B value ofE.angustifoliawas -1.41‰;TamarixchinensisorFraxinuschinensiscould be the reference plant ofE.angustifolia; the biological nitrogen fixation percentage ofE.angustifoliawas 55.03%. The biological nitrogen fixation percentage ofE.angustifoliain moderate salinity field was 69.69%. In the experimental condition, among three saline-tolerant tree species ofE.angustifolia,T.chinensisandF.chinensis,E.angustifoliahad the highest nitrogen contents in whole plants, roots, stems and leaves, and the contents were significantly different from other species (P<0.05); the nitrogen and carbon content ratio and the nitrogen and phosphorus content ratio ofE.angustifoliawere the highest; the nitrogen and phosphorus content ratios of leaf, stem and root ofE.angustifoliawere the highest. The nitrogen and carbon content ratio and the nitrogen and phosphorus content ratio ofE.angustifolialeaves in moderate salinity field were the highest.Conclusion15N natural abundance method can be applied to the study of biological nitrogen fixation ability ofE.angustifoliaunder salt stress, andT.chinensisandF.chinensiscan be selected as the reference plants;E.angustifoliahas relatively strong biological nitrogen fixation ability under salt stress, and it is an excellent tree species for biological improvement of saline soil. This study indicates that15N natural abundance method can be used to estimate biological nitrogen fixation under salt stress, and the results are significant for the selection of plants used to saline soil bioremediation and comprehensive development and utilization of saline-tolerant trees.

salt stress;Elaeagnusangustifolia; biological nitrogen fixation; saline-tolerant trees

10.13275/j.cnki.lykxyj.2017.06.014

2017-03-09

國家自然科學基金青年科學基金(31400571)；國家“十三五”科技支撐計劃項目“鹽堿逆境高抗穩定植物種質優選技術與示范(2015BAD07B0102)”；中央級公益性科研院所基本科研業務費專項資金(CAFYBB2014QB052)。

魏 琦(1983—)，女，博士，高級工程師，主要從事林業科技推廣工作。E-mail: weiq127@163.com

* 通訊作者：男，副研究員，主要從事耐鹽堿植物選育與鹽堿地生物治理研究。E-mail: xiangzilz@163.com

S791

A

1001-1498(2017)06-0985-08

崔 貝)