1,25-二羥維生素D3對哮喘大鼠氣道平滑肌細胞增殖及RhoA表達的影響

田維敏，宿 桐，黃 萍，吳妙心

1,25-二羥維生素D3對哮喘大鼠氣道平滑肌細胞增殖及RhoA表達的影響

田維敏1*，宿 桐2，黃 萍1，吳妙心1

目的觀察1,25-(OH)2D3對哮喘大鼠AMSCs增殖及RhoA表達的影響，探討其在哮喘治療中的作用。方法用卵白蛋白致敏和激發建立急性哮喘模型，原代培養急性哮喘大鼠的ASMCs，以1,25-(OH)2D3作為干預因素，CCK8法檢測1,25-(OH)2D3對ASMCs增殖的影響,測定細胞增殖活力；用TNF-α、1,25-(OH)2D3和地塞米松(DXM)處理體外培養的急性哮喘大鼠ASMCs并分組：對照組(N)、哮喘組(A組)、1,25-(OH)2D3組(VD組)、DXM組、1,25-(OH)2D3+DXM聯合治療組(L組)。用Transwell小室檢測細胞遷移；流式細胞儀測定細胞周期。同時采用Real time PCR和Western blot方法檢測肺組織和ASMCs中RhoA的表達變化，研究其作用機制。結果1,25-(OH)2D3在10-9～10-6mol/L濃度下能顯著抑制ASMCs的增殖，且為濃度依賴性(P<0.05)；1,25-(OH)2D3對哮喘大鼠的ASMCs的抗增殖作用呈現時間依賴性；1,25-(OH)2D3對哮喘大鼠的ASMCs遷移有明顯的抑制作用；1,25-(OH)2D3顯著抑制哮喘大鼠ASMCs細胞周期中G1/S期的轉化；1,25-(OH)2D3抑制并減少了RhoA/Rho激酶信號通路中RhoA基因和蛋白的表達。結論1,25-(OH)2D3能顯著抑制哮喘大鼠ASMCs的增殖、遷移及細胞周期的進展，這種多重的抑制作用可能是其通過調控RhoA/Rho激酶信號通路而實現其調節哮喘氣道炎癥、AHR和氣道重塑的作用機制之一。

哮喘；1,25-二羥維生素D3；氣道平滑肌細胞；增殖；遷移；細胞周期；RhoA

0 引言

支氣管哮喘的發病機制復雜，氣道慢性炎癥、氣道高反應性(Airway hyperresponsiveness,AHR)和不可逆性氣流受阻是哮喘的三大特征，除炎癥細胞外，氣道結構細胞如氣道平滑肌細胞(Airway smooth muscle cells，ASMCs)、成纖維細胞和上皮細胞也發揮著重要的作用[1]。ASMCs具有收縮功能，能表達黏附分子，釋放細胞因子，產生基質成分和金屬蛋白酶等，這些物質可促進ASMCs增殖，加重氣道重構[2]，并與AHR密切相關。ASMCs增生和肥大是氣道重塑的主要病理改變，而氣道重塑最終可導致不可逆的氣流阻塞及肺功能進行性和持續性的損害，有效抑制ASMCs的過度增殖，是治療哮喘的重要途徑。

糖皮質激素是治療哮喘的基本藥物,主要通過抑制氣道炎癥和ASMCs增殖來治療哮喘[3]，但其長期吸入是否會導致全身不良反應仍不清楚，且糖皮質激素無法完全阻斷炎性遞質。有研究顯示,吸入糖皮質激素可引起腎上腺功能抑制。

1,25-二羥維生素D3[1,25-dihydroxyvitamin D3,1,25-(OH)2D3] 是體內最重要的維生素D的活性代謝產物，可作用于免疫反應，在防治自身免疫性疾病方面亦有一定療效[4-5]。1,25-(OH)2D3可有效抑制多種類型細胞的增殖和誘導細胞凋亡，Kim等[6]的研究表明,1,25-(OH)2D3抑制了VEGF誘導的ASMCs增殖并使細胞周期停滯，但其在哮喘中對ASMCs的作用機制目前尚未明確，本研究就此進行探討。

1 材料與方法

1.1 材料 健康雌性SPF級Wistar大鼠，體重150～160 g，由廈門大學醫學院動物實驗中心提供。卵白蛋白(Ovalbumin,OVA)購自美國Sigma公司，滅活百日咳桿菌疫苗購于北京生物制品研究所，1,25-(OH)2D3口服制劑購自美國Sigma公司，布地奈德混懸液購自澳大利亞阿斯利康公司，重組人TNF-α、RhoA購于Peprotech公司，地塞米松(Dexamethasome,DXM)購于Sigma公司。

1.2 方法

1.2.1 模型制作 按照Wistar大鼠哮喘模型制作方法制作哮喘模型[7]。根據隨機化分配原則將40只SPF級Wistar大鼠分為5組，每組8只。正常對照組(N組)、哮喘組(A組)、1,25-(OH)2D3組(VD組)、布地奈德組(P組)和1,25-(OH)2D3與吸入用布地奈德混懸液聯合治療組(L組)。

1.2.2 取材、細胞的純化及傳代 取前述哮喘模型大鼠，10%水合氯醛40 mg/kg麻醉，無菌取氣管，剝離氣管內、外膜及軟骨，剪碎剩余的平滑肌條。經離心，胰酶和Ⅳ型膠原酶消化后，應用差速貼壁法來純化細胞，然后接種至培養瓶中進行培養，當細胞長至80%～90%融合時進行傳代。

1.2.3 細胞分組 將培養至4～6代長致80%融合的急性哮喘模型大鼠的ASMCs做同步化處理，進行分組并參照文獻[4-5,8-9]處理細胞：對照組(N組)為急性哮喘模型組、TNF-α組(A組)、1,25-(OH)2D3組(VD組)、DXM組(P組)、1,25-(OH)2D3+DXM 聯合治療組(L組)。

1.2.4 確定1,25-(OH)2D3作用的最佳濃度 取對數生長期的ASMCs，以6×103/well接種于96孔培養板內孵育，待細胞完全貼壁伸展后將其同步化，給予TNF-α刺激，并將細胞分6個亞組：分別加入10-6～10-11mol/L 1,25-(OH)2D3孵育24 h，每孔加入CCK8液孵育1 h，選擇450 nm波長，用自動酶聯檢測儀測定各孔吸光度值，記錄、分析、確定1,25-(OH)2D3最佳作用濃度。

1.2.5 確定1,25-(OH)2D3作用的最佳時間 繼續用CCK8法對1,25-(OH)2D3進行多時間點的抗增殖作用檢測。分別于1,25-(OH)2D3刺激后12、24、36、48 h各取一塊培養板，檢測A450nm值，比較各時間點下1,25-(OH)2D3對ASMCs的增殖抑制率，確定1,25-(OH)2D3的最佳作用時間。

1.2.6 Transwell小室檢測ASMCs的跨膜遷移 將Transwell小室上下室之間用預處理的孔徑8 μm的聚碳酸脂膜隔開。上室加入細胞懸液，下室加入趨化誘導物。按“1.2.3”項下方法分組，24 h后加入24孔板中，置于培養箱培養24 h，細胞通過膜上的小孔遷移、黏附到膜的下面，將膜下面的ASMCs經固定、染色、透明及封片，倒置顯微鏡(200×)下隨機計數5個視野的細胞數，取均值。

1.2.7 流式細胞儀檢測 ASMCs的細胞周期取對數生長期ASMCs接種于25 mL培養瓶內，細胞完全貼壁伸展且匯合近瓶底面積的80%時，棄上清。按Transwell小室細胞分組方法給細胞分組和處理，孵育24 h，然后消化、水洗，制備細胞懸液，經離心、棄上清、酒精固定等處理后，將1×10-7個ASMCs懸浮于1 mL碘化吡啶染液中37 ℃避光30 min，用流式細胞儀檢測各組細胞周期。

依公式PI=(S+G2/M)/(G0/1+S+G2/M)×100%計算細胞增殖指數(PI)。

詢問了解患者的亞急性甲狀腺炎情況與病史，對患者進行詳細的身體檢查，進行確切的診斷，了解患者的禁忌情況等，以上檢查與詢問情況進行保密。本組患者同時進行核醫學及超聲檢查。

1.2.8 RT-PCR檢測大鼠肺組織和ASMCs中RhoA的mRNA表達 采用SYBR Green I熒光染料嵌合法，分別制作目的基因RhoA和管家基因GAPDH的標準曲線。利用標準曲線對樣品中的目的基因和管家基因分別進行定量。采用TRIzol法抽提總RNA，并逆轉錄合成cDNA，再以此模板進行PCR擴增。引物序列見表1。

表1 引物序列

擴增片段長度114 bp。反應條件：95 ℃變性30 s，95 ℃退火5 s，60 ℃延伸34 s，共40個循環。以預實驗中Ct值為18的樣品作為標準品，用RNasefree dH20依次稀釋，與樣品同時擴增。反應結束后進行標準梯度點分析，若相關系數γ2>0.96，表明線性關系良好，可確定為定量標準曲線。根據標準曲線，熒光定量PCR儀自動分析并計算結果，待測基因mRNA的相對表達量應用2-△△Ct方法得出相對倍數。

1.2.9 Western blot檢測各組大鼠肺組織及細胞中RhoA蛋白表達 取出凍存的標本，將組織塊剪碎，消化收集各組細胞，裂解離心提取蛋白質，將樣本用裂解緩沖液稀釋，各標本蛋白上樣50 μL，上清用12% 聚丙烯酰胺凝膠電泳后，再轉印至硝酸纖維素膜。用含5%去脂奶粉的TBS封閉4 ℃過夜。取出膜后，TBS洗膜，加入一抗(1∶400)，室溫下孵育2 h，加入堿性磷酸酶標記的二抗(1∶2 000)，室溫下孵育2 h，清洗，發光。每組實驗均重復3次，采用FlourChem V 2.0凝膠成像分析軟件(America)分析，記錄每條蛋白電泳帶的灰度值，進行定量分析。蛋白含量=樣本蛋白灰度值/同一樣本β-actin灰度值。

2 結果

2.1 CCK8法檢測1,25(OH)2D3對ASMCs增殖活力的影響 在TNF-α刺激的ASMCs增殖的基礎上，分別加入不同濃度1,25(OH)2D3培養24 h，用CCK8法測定各組A450nm吸光度值，發現10-9～10-6mol/L的VD組A450nm值均較A組明顯下降，具有濃度依賴性，因10-7mol/L作用已非常明顯，故選10-7mol/L作為后續的實驗研究，見表2。

表2 不同濃度1,25(OH)2D3對ASMCs增殖活力的影響(n=8)

注：a.與N組比較，P<0.01；b.與A組、VD 10-11mol/L、VD 10-10mol/L比較，P<0.01；c.與VD 10-9mol/L比較，P<0.01；d.與VD 10-8mol/L比較，P<0.05；e.與VD 10-8mol/L比較，P<0.01；f.與VD 10-7mol/L比較，P<0.01

2.2 用CCK8法對10-7mol/L 1,25(OH)2D3抗ASMCs增殖的多時間點作用的檢測 用CCK8法對10-7mol/L 1,25(OH)2D3進行多時間點的抗增殖作用檢測，可見隨時間延長，1,25(OH)2D3對TNF-α刺激的ASMCs的抗增殖作用越明顯，具有時間依賴性，見表3。

表3 10-7mol/L 1,25(OH)2D3對TNF-α刺激的ASMCs增殖的影響(A450nm吸光度值)(n=8)

注：a.與N組比較，P<0.05；b.與A組比較，P<0.05

2.3 1,25(OH)2D3對TNF-α刺激的ASMCs遷移的影響 由表4可見，1,25(OH)2D3對TNF-α刺激的ASMCs的遷移有明顯的抑制作用，其遷移細胞數較A組明顯減少(P<0.01)，較P組增多，差異有統計學意義(P<0.01)；聯合治療組較VD組和P組明顯減少，差異有統計學意義(P<0.05)。提示1,25(OH)2D3可以抑制TNF-α誘導的ASMCs遷移，但其作用弱于DXM，二者聯合應用作用明顯。

2.4 1,25(OH)2D3對TNF-α處理的ASMCs細胞周期的影響 采用流式細胞儀檢測各組細胞的細胞周期。結果顯示，TNF-α刺激后，ASMCs的PI較N組明顯增高(P<0.05)，而VD組PI降低(P<0.05)；進一步比較細胞周期的時相分布，可見1,25(OH)2D3顯著增加了TNF-α刺激的G0/1期比例(P<0.05)，相應地減少了S期及G2/M期的比例(P<0.05)，即阻止了細胞由G0/1期向S期的轉化；但其作用弱于P組和L組(P<0.05)，見表5。

表4 各組ASMCs遷移情況(n=8)

注：a.與N組比較，P<0.01；b.與A組比較，P<0.05；c.與VD組比較，P<0.05；d.與P組比較，P<0.05

表5 各組ASMCs細胞周期比較(n=5)

注：a.與N組比較，P<0.05；b.與A組比較，P<0.05；c.與VD組比較，P<0.05；d.與P組比較，P<0.05

2.5 Real time PCR檢測1,25(OH)2D3對哮喘大鼠氣道及平滑肌細胞RhoA mRNA表達的影響 實時定量PCR的相對定量分析顯示，在肺組織與ASMCs水平上，各模型組大鼠RhoA特異產物的融解溫度為88.0 ℃。經GAPDH內參照標化后，比較各目的基因mRNA的相對含量，可見各組均較C組增高(P<0.01)；各治療組經治療后,較TNF-α組顯著下降(P<0.01)；1,25(OH)2D3作用弱于P組和L組(P<0.01)；L組作用明顯優于VD組、P組，組織水平上仍高于N組(P<0.05)，但細胞水平上與N組比較差異無統計學意義(P>0.05)，見表6。

2.6 Western blot檢測1,25(OH)2D3對哮喘大鼠氣道及平滑肌細胞RhoA蛋白表達的影響 在肺組織與ASMCs水平上，VD組、P組及L組均顯著下調了哮喘大鼠RhoA的蛋白表達(P<0.01)；L組與N組比較，差異無統計學意義(P>0.05)。說明在治療哮喘方面，1,25(OH)2D3與糖皮質激素聯合應用有協同效應,見表7、圖1、圖2。

表6 各組大鼠肺組織及ASMCs中RhoA mRNA表達

注：a.與N組比較，P<0.01；b.與A組比較，P<0.01；c.與VD組比較，P<0.01；d.與P組比較，P<0.01

表7 各組大鼠肺組織及ASMCs中RhoA蛋白表達灰度值(n=3)

注：a.與N組比較，P<0.01；b.與A組比較，P<0.01；c.與VD組比較，P<0.01；d.與P組比較，P<0.05

圖1 肺組織中RhoA的蛋白表達

圖2 ASMCs中RhoA的蛋白表達

3 討論

哮喘是一種以氣道慢性炎癥、AHR和氣道重塑為特征的異質性疾病。氣道重塑是指發生在氣道的結構改變，包括炎癥細胞浸潤、杯狀細胞增生、黏液分泌增加、細胞外基質沉積、基底膜和平滑肌層增厚、新生血管生成等[10]，與氣道慢性炎癥、ASMC功能紊亂共同構成支氣管哮喘的三個主要病理特征。氣道重塑與哮喘患者預后不良有關，直接影響患者病情轉歸。因此，識別支氣管氣道重塑的分子生物學機制對哮喘的治療尤為重要。

ASMCs是各種炎癥介質和神經遞質引起收縮的部分，也是各種炎癥因子、細胞因子、趨化因子及生長因子的來源，存在收縮和合成兩種表型，二者在一定條件下可以相互轉化，其特點為強大的生長和遷移能力。ASMCs的遷移是哮喘氣道重塑的重要特征之一。各種絲裂原和介導ASMCs增殖的信號轉導途徑均可導致ASMCs的增殖、遷移和細胞周期的進展[11-13]。細胞周期有兩個關鍵性限制點，分別為G1/S 期、G2/M 期[14]，細胞在G1期對細胞外信號發生應答，如能越過G1/S 期限制點，則細胞周期就可自主進行,故G1期時程決定了細胞周期的長短。哮喘時，細胞外的各種絲裂原通過不同的信號轉導途徑促進ASMCs 增殖，因此，若能阻斷細胞完成細胞分裂周期，就可望達到控制或逆轉氣道重構的目的，從而控制哮喘。

Rho/Rock信號通路參與細胞的多種生物學行為，可調節結構細胞、炎癥細胞、細胞因子和炎癥介質等[15]。Rho蛋白是具有GTP酶活性的Ras超家族中的小分子G蛋白成員，以活化的Rho-GTP 形式和非活化的Rho-GDP 形式兩種狀態存在于細胞質中，具有活性的RhoA可影響細胞的骨架結構和形態，使平滑肌產生收縮等生理功能。Rock是Rho 激酶下游靶效應分子，以兩種同源性極高的異構體形式存在(Roka/Rock2、Rokβ/Rockl)，分別存在于肺、肝臟、骨骼肌、心臟等組織器官中[16]。多種炎癥介質和細胞因子等可使Rho活化，ROCK與GTP結合蛋白Rho相互作用，通過磷酸化激活多種下游蛋白或核因子，從而引起細胞骨架、肌動蛋白纖維的形成和組裝，在機體的各項調節功能中起重要作用。研究表明，Rho/Rho激酶信號通路選擇性抑制劑可明顯抑制5-HT誘導的大鼠ASMC的增殖，且使細胞停滯于G0/G1期。抑制Rho激酶可以減少氣道重塑和AHR，還可以減少氣道炎癥和氧化應激[17]。綜上所述，Rho/Rock激酶信號通路可通過介導ASM收縮、成肌纖維細胞分化和ASMCs成熟、氣道壁間質細胞增殖和遷移以及炎癥細胞的遷移，在哮喘等慢性氣道炎癥疾病的發生過程中發揮重要作用。

吸入糖皮質激素是目前長期預防和治療哮喘的一線藥物[18]，主要通過抑制氣道炎癥治療哮喘,并能有效抑制ASMCs 的增殖，但其作用是非特異的，長期應用會引起一系列代謝及內分泌紊亂等不良反應，且隨著病程的進展，哮喘患者還有可能出現不同程度的氣道重塑，最終發展成為不可逆的氣流阻塞。

維生素D缺乏與哮喘、過敏性鼻炎和喘息密切相關[19-20]，可導致哮喘加重[21]，增加炎癥介質誘導的氣道重塑[22]。1,25-(OH)2D3可抑制多種類型細胞的增殖和細胞因子的產生[23]，同時可誘導細胞的凋亡和分化[24]。本課題組既往研究發現，1,25-(OH)2D3通過部分抑制哮喘大鼠氣道和血清中Eotaxin、IL-8、IgE的產生等來減少氣道炎癥、AHR和改善肺功能[25]。另有研究發現，維生素D可增強激素抵抗性哮喘和激素敏感性哮喘患者單核細胞的抗炎效應，并可增強激素的作用[26]。Th17細胞因子在哮喘,包括激素抵抗性哮喘的發病機制中起重要作用，嚴重哮喘患者Th17細胞因子水平增加。Th17不能被類固醇激素抑制，而1,25-(OH)2D3可通過T細胞和DCs介導的通路抑制Th17細胞因子的產生，表明維生素D對于哮喘患者可增強類固醇的效應[27-28]。

本實驗采用CCK8法檢測在10-11～10-6mol/L濃度范圍內1,25(OH)2D3對ASMCs增殖活力的影響。研究發現，1,25-(OH)2D3在10-9～10-6mol/L濃度范圍內對ASMCs表現出明顯的濃度依賴性的增殖抑制作用；1,25(OH)2D3可抑制哮喘大鼠的ASMCs的增殖和遷移，將細胞阻滯在細胞周期的G1期而產生增殖抑制效應。1,25-(OH)2D3減少了RhoA蛋白和mRNA的表達，抑制了Rho/ROCK信號通路，進而抑制了哮喘的氣道炎癥、AHR和氣道重塑。1,25-(OH)2D3在本部分試驗中的作用弱于糖皮質激素，但聯合應用作用明顯，表明1,25(OH)2D3可以增強類固醇效應。然而，亦有研究發現，維生素D3并沒有降低持續性哮喘和維生素D缺乏的成人哮喘患者首次治療失敗或加重的發生率[29]，這些研究結果不支持有癥狀的哮喘患者補充維生素D3治療的戰略。因此，1,25-(OH)2D3，在臨床上是否能輔助糖皮質激素治療哮喘，還有待于進一步探討，以期發現更合理的臨床應用方式。

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Effectsof1,25-dihydroxyvitaminD3onproliferationofASMCsandRhoAinasthmaticrats

TIAN Wei-min1*,SU Tong2,HUANG Ping1,WU Miao-xin1

(1.Department of Pediatrics,Zhongshan Hospital,Xiamen University,Xiamen 361004,China;2.the First Clinical College,Tongji Medical College of Huazhong University of Science and Technology,Wuhan 430030,China)

ObjectiveTo observe the effect of 1,25-(OH)2D3on proliferation of ASMCs and RhoA in asthma rats,and explore its role in the treatment of asthma.MethodsAcute asthma models of Wistar rats were established with ovalbumin sensitizing and challenging,ASMCs of acute asthmatic rats were primarily cultured.1,25-(OH)2D3as the intervention factors,the effect of 1,25-(OH)2D3on proliferation and proliferation activity of ASMCs was determined by CCK8.The cultured ASMCs of acute asthma rat in vitro were divided into 5 groups:control group (group N),TNF-α group (group A),1,25-(OH)2D3group (group VD),DXM group,1,25-(OH)2D3+DXM group (group L). The cell migration was detected by Transwell chamber;cell cycle was analyzed by flow cytometry. Meanwhile,the expression of RhoA in lung tissue and ASMCs was detected by Real time PCR and Western blot,and the mechanism of action was analyzed.Results1,25-(OH)2D3could significantly inhibit the proliferation of ASMCs in a concentration dependent manner (P<0.05);1,25-(OH)2D3had anti-proliferative effects on ASMCs of asthmatic rats in a time dependent manner;1,25-(OH)2D3had obviously inhibitory effect on the migration of ASMCs in asthmatic rats;1,25-(OH)2D3could significantly inhibit the cell cycle conversion during G1/S period in ASMCs of asthma rats;1,25- (OH)2D3could inhibit and decrease the expression of RhoA gene and protein in Rho/Rho kinase signaling pathway.Conclusion1,25-(OH)2D3can inhibit the proliferation,migration and cell cycle progression of ASMCs,which may be one of the mechanisms by which RhoA/Rho kinase signaling pathway regulates airway inflammation,AHR and airway remodeling in asthma.

Asthma;1,25-(OH)2D3;ASMCs;Proliferation;Migration;Cell cycle;RhoA

2017-06-05

1.廈門大學附屬中山醫院兒科，廈門 361004;2.華中科技大學同濟醫學院第一臨床學院，武漢 430030

福建省自然科學基金項目(2016J01615)

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10.14053/j.cnki.ppcr.201712002