麥角甾醇對(duì)LPS誘導(dǎo)的肺損傷小鼠的抗炎作用研究

葛金林，曾余豐，錢俊敏，金晨慈

麥角甾醇對(duì)LPS誘導(dǎo)的肺損傷小鼠的抗炎作用研究

葛金林1*，曾余豐1，錢俊敏2，金晨慈1

目的研究麥角甾醇對(duì)LPS誘導(dǎo)的小鼠急性肺損傷的抗炎作用研究。方法取50只雄性BABL/c小鼠隨機(jī)分為5組：空白對(duì)照組、模型組、地塞米松組(2 mg/kg)、麥角甾醇低劑量組(20 mg/kg)、麥角甾醇高劑量組(40 mg/kg)。空白對(duì)照組和模型組按體積給予生理鹽水，地塞米松組(2 mg/kg)、麥角甾醇組(20、40 mg/kg)灌胃給予相應(yīng)藥物。給藥1 h后，除空白對(duì)照組，其余各組小鼠氣管滴注20 μg LPS。檢測(cè)小鼠肺干濕重比(W/D)，肺泡灌洗液(BALF)中超氧化物歧化酶(SOD)水平、丙二醛(MDA)含量，血清與肺泡灌洗液炎性細(xì)胞因子(TNF-α、IL-1β、IL-6)水平。取各組小鼠肺組織做HE染色，并檢測(cè)肺組織Rho、ROCK1、ROCK2、p-NF-κBP65、NF-κBP65、p-IκBα、IκBα蛋白表達(dá)。結(jié)果麥角甾醇20、40 mg/kg能顯著提升LPS誘導(dǎo)的急性肺損傷小鼠血清SOD水平，降低MDA含量；改善血清及肺泡灌洗液炎癥因子水平和肺組織病理學(xué)改變；降低肺組織Rho、ROCK1、ROCK2、p-NF-κBP65、p-IκBα蛋白表達(dá)。結(jié)論麥角甾醇對(duì)LPS誘導(dǎo)的急性肺損傷小鼠有保護(hù)作用，其作用可能與Rho/ROCK/NF-κB信號(hào)通路有關(guān)。

麥角甾醇；肺損傷；Rho/ROCK/NF-κB

0 引言

急性肺損傷是指各種直接和間接致傷因素導(dǎo)致的肺泡上皮細(xì)胞及毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷，造成彌漫性肺間質(zhì)及肺泡水腫，導(dǎo)致急性低氧性呼吸功能不全[1]。急性肺損傷的病理生理特征是肺容積減少、肺順應(yīng)性降低、通氣/血流比例失調(diào)等[2]。急性肺損傷在臨床上是較為常見的急危重癥之一，主要病理生理學(xué)改變是炎癥反應(yīng)。如果控制不當(dāng)，急性肺損傷可能發(fā)展成為急性呼吸窘迫綜合征，引起多器官臟器功能衰竭[3]。因此，尋找治療急性肺損傷的藥物并研究其作用機(jī)制，改善患者的生存質(zhì)量，已經(jīng)成為當(dāng)前的研究熱點(diǎn)。

麥角甾醇又稱為麥角固醇，是一種甾體類化合物。麥角甾醇是微生物細(xì)胞膜的重要組成部分，對(duì)確保細(xì)胞膜的完整性、膜結(jié)合酶的活性、膜的流動(dòng)性、細(xì)胞活力及細(xì)胞物質(zhì)運(yùn)輸?shù)绕鹬匾饔肹4]。本研究擬觀察麥角甾醇對(duì)急性肺損傷小鼠的保護(hù)作用。

Rho蛋白是小G蛋白超家族的亞家族成員，目前已經(jīng)發(fā)現(xiàn)20多種Rho家族成員。根據(jù)序列的同源程度和功能可分為RhoA、Racl、Cdc42及缺乏GTP酶活性等4類[5]。Rho的下游靶蛋白是ROCK，又稱Rho激酶。Rho激酶是絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶家族成員，又稱為Rho相關(guān)激酶，在缺血、炎癥、外傷等多種病理因素中起重要作用[6]。其參與細(xì)胞黏附、遷移和細(xì)胞骨架重構(gòu)、調(diào)劑中性粒細(xì)胞產(chǎn)生的活性氧等。研究表明，RhoA在炎癥應(yīng)答過(guò)程中起重要作用[7]。轉(zhuǎn)錄因子NF-κB的主要形式為p50、p65和IκBα。研究表明，NF-κB可以激活、調(diào)節(jié)、轉(zhuǎn)錄下游炎癥因子表達(dá)。本研究探討了麥角甾醇對(duì)急性肺損傷的作用機(jī)制是否通過(guò)Rho/ROCK/NF-κB信號(hào)通路起作用。

1 材料與試劑

1.1 材料與試劑 麥角甾醇 (純度：97%)購(gòu)自中國(guó)食品藥品檢定研究院。地塞米松(Dex)購(gòu)自南京先聲藥業(yè)。脂多糖(LPS，大腸桿菌血清型0111∶B4，No.L-2630，Sigma-Aldrich，St.Louis，MO，USA)、IL-1β、IL-6和TNF-α酶聯(lián)免疫試劑盒由南京凱基生物科技有限責(zé)任公司提供。MDA、SOD試劑盒由南京建成生物試劑有限公司提供。Rho、ROCK1、ROCK2、p-IκBα、IκBα、NF-κBp65、p-NF-κBp65抗體均由Cell Signaling Technology (Danvers，USA)公司提供。

1.2 動(dòng)物 50只BALB/c小鼠(體重：20～22 g)由揚(yáng)州大學(xué)比較醫(yī)學(xué)中心提供。所有動(dòng)物于室溫(22±1)℃，空氣濕度40%～50%，晝夜交替時(shí)間12 h條件下普通飼料喂養(yǎng)，自由飲水。

2 方法

2.1 分組及給藥 取50只雄性BABL/c小鼠隨機(jī)分為5組：空白對(duì)照組、模型組、地塞米松組(2 mg/kg)、麥角甾醇低劑量組(20 mg/kg)、麥角甾醇高劑量組(40 mg/kg)。空白對(duì)照組和模型組按體積給予生理鹽水，地塞米松組(2 mg/kg)、麥角甾醇組(20、40 mg/kg)灌胃給予相應(yīng)藥物。給藥1 h后，除空白對(duì)照組，其余各組小鼠氣管滴注20 μg LPS(溶于50 μL PBS)，空白對(duì)照組氣管內(nèi)滴注50 μL PBS。

2.2 肺泡灌洗液收集 給藥6 h后處死小鼠，抽取500 μL預(yù)冷的PBS (pH 7.2)，用注射器緩慢注入左肺并灌洗，回抽得到肺泡灌洗液(BALF)。抽取3次后，將肺泡灌洗液以1 500 r/min、4 ℃離心10 min，取上清液凍存于-80 ℃?zhèn)溆谩?/p>

2.3 肺干濕重比測(cè)定 將右側(cè)肺組織取出，分離食管和氣管，測(cè)量濕重；將其置于60 ℃烘箱內(nèi)48 h至恒重，測(cè)量干重，計(jì)算肺干濕重比值(干重/濕重×100%)。

2.4 組織病理學(xué)檢查 小鼠眼眶取血后處死，將肺組織固定于4%的中性福爾馬林溶液中過(guò)夜。將組織固定包埋于石蠟中，切成4 mm厚的切片。去石蠟，用蘇木素-伊紅染液染色(HE染色)，采用光學(xué)顯微鏡觀察肺損傷和肺部炎癥細(xì)胞的浸潤(rùn)情況。

2.5 肺泡灌洗液中SOD、MDA含量測(cè)定 按照試劑盒說(shuō)明書測(cè)定LPS誘導(dǎo)的急性肺損傷小鼠肺泡灌洗液中SOD、MDA的含量。

2.6 血清與肺泡灌洗液中炎癥因子的測(cè)定 小鼠眼眶取血，4 500 r/min離心15 min后取上清液凍存于-80 ℃?zhèn)溆谩０凑誆LISA試劑盒說(shuō)明書檢測(cè)LPS誘導(dǎo)的急性肺損傷小鼠肺泡灌洗液中IL-1β、IL-6、TNF-α的含量。

2.7 Western blot分析 將肺組織剪碎，用RIPA裂解液進(jìn)行提取總蛋白，12 000 r/min條件下離心15 min，收集上清后采用BCA試劑盒進(jìn)行蛋白定量。蛋白樣品置于SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳中直至樣品到達(dá)分離膠的底部，并將其轉(zhuǎn)移到PVDF膜上。轉(zhuǎn)膜完畢后，將條帶浸入5%脫脂牛奶中封閉2 h。封閉結(jié)束后將PVDF膜浸入一抗中于4 ℃孵育過(guò)夜。第2天棄一抗，用TBST洗4次后，加入第2抗體于搖床室溫孵育2 h。二抗孵育結(jié)束后，棄抗體，取出PVDF膜用TBST清洗4次。使用凝膠成像系統(tǒng)進(jìn)行曝光并用凝膠掃描成像系統(tǒng)掃描條帶分析各條帶灰度值。

3 結(jié)果

3.1 麥角甾醇對(duì)急性肺損傷小鼠肺組織干濕重比的影響 如圖1所示，與空白對(duì)照組比較，模型組小鼠在給予LPS造模之后，肺干濕重比顯著增加。與模型組相比，麥角甾醇組肺干濕重比值降低。

3.2 麥角甾醇對(duì)急性肺損傷小鼠肺泡灌洗液中MDA、SOD的影響 與空白對(duì)照組比較，模型組小鼠注射LPS后，MDA含量增加，SOD活力降低。與模型組比較，麥角甾醇可以顯著降低MDA含量，提升SOD 活力。見圖2。

圖1 各組小鼠肺組織干濕重比比較

注：C.空白組，M.模型組，D.地塞米松2 mg/kg組，EL.麥角甾醇20 mg/kg組，EH.麥角甾醇40 mg/kg組*與M組比較，P<0.01；#與C組比較，P<0.01

圖2 各組小鼠肺泡灌洗液中MDA、SOD比較

注：C.空白組，M.模型組，D.地塞米松2 mg/kg組，EL.麥角甾醇20 mg/kg組，EH.麥角甾醇40 mg/kg組*與M組比較，P<0.01；#與C組比較，P<0.01

3.3 麥角甾醇對(duì)急性肺損傷小鼠肺組織病理的影響 如圖3所示，與空白對(duì)照組相比，模型組小鼠在注射LPS之后，肺組織可見明顯的炎性細(xì)胞浸潤(rùn)。與模型組相比，麥角甾醇可以顯著減少炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，表現(xiàn)出對(duì)LPS誘導(dǎo)的肺損傷小鼠的保護(hù)作用。

3.4 麥角甾醇對(duì)急性肺損傷小鼠血清與肺泡灌洗液中炎性細(xì)胞因子表達(dá)的影響 與空白對(duì)照組比較，模型組小鼠在注射LPS后，血清與肺泡灌洗液中IL-1β、IL-6、TNF-α等炎性細(xì)胞因子含量顯著增加。與模型組比較，麥角甾醇降低血清與肺泡灌洗液中IL-1β、IL-6、TNF-α含量，改善LPS誘導(dǎo)的急性肺損傷小鼠炎性細(xì)胞因子的表達(dá)。見圖4。

3.5 麥角甾醇對(duì)急性肺損傷小鼠Rho/ROCK/NF-κB信號(hào)通路表達(dá)的影響 采用Western blot檢測(cè)麥角甾醇對(duì)急性肺損傷小鼠相關(guān)蛋白表達(dá)的影響，以確定其相關(guān)作用機(jī)制。與空白對(duì)照組相比，模型組小鼠在給予LPS后，p-NF-κB、p-IκBα、Rho、ROCK1 ROCK2的表達(dá)上調(diào)，麥角甾醇治療后，以上蛋白的表達(dá)顯著下調(diào)。結(jié)果表明，麥角甾醇可能通過(guò)Rho/ROCK/NF-κB信號(hào)通路改善LPS誘導(dǎo)的小鼠急性肺損傷。見圖5。

圖3 麥角甾醇對(duì)急性肺損傷小鼠肺組織病理的影響(200×)

圖4 麥角甾醇對(duì)急性肺損傷小鼠血清與肺泡灌洗液中炎性細(xì)胞因子表達(dá)的影響

圖5 麥角甾醇對(duì)急性肺損傷小鼠Rho/ROCK/NF-κB信號(hào)通路表達(dá)的影響

4 討論

急性肺損傷是急性呼吸窘迫綜合征的早期階段，其病理特征為肺彌漫性損害、肺泡毛細(xì)血管通透性增加、肺泡內(nèi)水腫等[8-9]。

炎性細(xì)胞因子釋放引發(fā)的肺組織炎癥反應(yīng)是導(dǎo)致急性肺損傷患者肺泡中毛細(xì)血管通透性增加的主要原因。中性粒細(xì)胞在其中發(fā)揮重要作用[10]。中性粒細(xì)胞是炎癥反應(yīng)過(guò)程中的主要細(xì)胞，激活后可以釋放IL-1β、IL-6、TNF-α，破壞毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞和肺泡上皮細(xì)胞間的緊密連接，導(dǎo)致肺泡毛細(xì)血管通透性增加[11]。TNF-α由單核細(xì)胞產(chǎn)生，具有免疫調(diào)節(jié)和炎癥調(diào)控功能。IL-1β是一種促炎細(xì)胞因子，參與組織水腫。IL-6具有免疫調(diào)節(jié)功能，可以增強(qiáng)免疫反應(yīng)[12]。本研究中，與空白對(duì)照組比較，模型組小鼠在給予LPS后，血清與肺泡灌洗液中IL-1β、IL-6、TNF-α含量升高。與模型組相比，麥角甾醇可以顯著降低以上炎癥因子的表達(dá)，表明麥角甾醇對(duì)LPS誘導(dǎo)的急性肺損傷小鼠有明顯的改善作用。

NF-κB是一種重要的轉(zhuǎn)錄因子，在調(diào)控IL-1β、IL-6、TNF-α等炎癥因子的過(guò)程中發(fā)揮重要作用[13]。在靜息狀態(tài)下，NF-κB與NF-κB肺抑制性蛋白(IκB)結(jié)合成為非活性狀態(tài)，存在于胞漿中。在LPS的刺激下，NF-κB從細(xì)胞質(zhì)轉(zhuǎn)入細(xì)胞核，從而啟動(dòng)炎性細(xì)胞因子的轉(zhuǎn)錄[14-15]。ROCK是絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，由ROCKⅠ和 ROCKⅡ 2種異構(gòu)體組成，是Rho下游的靶效應(yīng)分子，與炎癥關(guān)系密切。Western blot 結(jié)果表明，麥角甾醇可以緩解LPS誘導(dǎo)的急性肺損傷，其機(jī)制可能與Rho/ROCK/NF-κB信號(hào)通路相關(guān)。

綜上所述，麥角甾醇可以緩解LPS誘導(dǎo)的急性肺損傷，其機(jī)制可能與Rho/ROCK/NF-κB信號(hào)通路有關(guān)。

[1] Ware LB,Matthay MA.Resolution of alveolar edema:mechanisms and relationship to clinical acute lung injury[J].Acute Respiratory Distress Syndrome,2016,233:237.

[2] 凌亞豪,魏金鋒,王愛(ài)平,等.急性肺損傷和急性呼吸窘迫綜合征發(fā)病機(jī)制的研究進(jìn)展[J].癌變·畸變·突變,2017,29(2):151-154.

[3] 李琴,樊佳,陳斌,等.自噬對(duì)脂多糖致大鼠急性肺損傷模型的炎癥調(diào)控[J].中華實(shí)用診斷與治療雜志,2017,31(4):328-331.

[4] 楊安倫,陳忠,李建生.響應(yīng)面設(shè)計(jì)法優(yōu)選金蟬花麥角甾醇提取工藝[J].實(shí)用藥物與臨床,2015,18(11):1351-1355.

[5] Zhu L,Chen T,Chang X,et al.Salidroside ameliorates arthritis-induced brain cognition deficits by regulating Rho/ROCK/NF-κB pathway[J].Neuropharmacology,2016,103:134-142.

[6] Huang Z,Nan C,Wang H,et al.Crocetin ester improves myocardial ischemia via Rho/ROCK/NF-κB pathway[J].Int Immunopharmacol,2016,38:186-193.

[7] Tsai SH,Huang PH,Peng YJ,et al.Zoledronate attenuates angiotensin II-induced abdominal aortic aneurysm through inactivation of Rho/ROCK-dependent JNK and NF-κB pathway[J].Cardiovasc Res,2013,100(3):501-510.

[8] Cooke KR,Yanik G.Acute lung injury after allogeneic stem cell transplantation:is the lung a target of acute graft-versus-host disease[J].Bone Marrow Transplant,2004,34(9):753-765.

[9] Briel M,Meade M,Mercat A,et al.Higher vs lower positive end-expiratory pressure in patients with acute lung injury and acute respiratory distress syndrome:systematic review and meta-analysis[J].JAMA,2010,303(9):865-873.

[10] 趙利利,戎浩,孫芳云.內(nèi)毒素致急性肺損傷的發(fā)病機(jī)制研究進(jìn)展[J].實(shí)用藥物與臨床,2015,18(4):466-469.

[11] 段煉,魏毅濤,劉曼玲,等.中草藥對(duì)急性肺損傷的保護(hù)機(jī)制研究進(jìn)展[J].醫(yī)學(xué)研究生學(xué)報(bào),2016,29(5):533-537.

[12] Wu X,Lu Y,Dong Y,et al.The inhalation anesthetic isoflurane increases levels of proinflammatory TNF-α,IL-6,and IL-1β[J].Neurobiol Aging,2012,33(7):1364-1378.

[13] Hung CN,Huang HP,Wang CJ,et al.Sulforaphane inhibits TNF-α-induced adhesion molecule expression through the Rho A/ROCK/NF-κB signaling pathway[J].J Med Food,2014,17(10):1095-1102.

[14] Sun H,Kamanova J,Lara-Tejero M,et al.A family of salmonella type III secretion effector proteins selectively targets the NF-κB signaling pathway to preserve host homeostasis[J].PLoS Pathog,2016,12(3):e1005484.

[15] Miyata K,Satou R,Shao W,et al.ROCK/NF-κB axis-dependent augmentation of angiotensinogen by angiotensin II in primary-cultured preglomerular vascular smooth muscle cells[J].Am J Physiol Renal Physiol,2014,306(6):F608-F618.

Anti-inflammatoryeffectsofergosterolonLPS-inducedlunginjuryinmice

GE Jin-lin1*,ZENG Yu-feng1,QIAN Jun-min2,JIN Chen-ci1

(1.Department of Respiratory Medicine,Wenzhou Integrated Traditional Chinese and Western Medicine Hospital,Wenzhou 325000,China;2.Department of Respiratory Medicine,Yongjia People′s Hospital,Wenzhou 325100,China)

ObjectiveTo investigate the anti-inflammatory effect of ergosterin on lipopolysaccharide (LPS)-induced acute lung injury (ALI).MethodsTotally 50 BABL/c mice were divided into 5 groups randomly:control group,model group,dexamethasone group (2 mg/kg),ergosterin (20 mg/kg),ergosterin (40 mg/kg).The mice were given ergosterin or dexamethasone at 1 h before intratracheal instillation of LPS.The lung wet-to-dry weight (W/D) ratio,the level of super oxide dismutase (SOD) and the content of malondialdehyde (MDA) in bronchoalveolar lavage fluid (BALF),and the levels of tumor necrosis factor-α (TNF-α),interleukin-1β (IL-1β) and interleukin-6 (IL-6) in BALF were detected.The protein expression of Rho,ROCK1,ROCK2,p-NF-κBP65,NF-κBP65,p-IκBα and IκBα in lung tissue was analyzed.ResultsErgosterin of 20 mg/kg and 40 mg/kg could increase the level of SOD and decrease the content of MDA,and improve the levels of pro-inflammatory cytokines in serum and BALF and pathological changes.It could also decrease the protein expression of Rho,ROCK1,ROCK2,p-NF-κBP65 and p-IκBα in lung tissue.ConclusionErgosterin can ameliorate the LPS-induced acute lung injury in mice and its related mechanism might be related to inhibition of Rho/ROCK/NF-κB pathway.

Ergosterin;Lung injury;Rho/ROCK/NF-κB

2017-07-20

1.溫州市中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院呼吸內(nèi)科，浙江 溫州 325000；2.永嘉縣人民醫(yī)院呼吸內(nèi)科，浙江 溫州 325100

浙江省中醫(yī)藥科研基金項(xiàng)目(2015ZB111)

*

10.14053/j.cnki.ppcr.201712003