萬壽菊番茄紅素β-環(huán)化酶基因及其啟動子克隆和功能分析

張春玲，王尼慧，王寧樂，包滿珠，何燕紅

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萬壽菊番茄紅素β-環(huán)化酶基因及其啟動子克隆和功能分析

張春玲，王尼慧，王寧樂，包滿珠，何燕紅

（華中農業(yè)大學園藝林學學院/園藝植物生物學教育部重點實驗室/農業(yè)部華中都市農業(yè)重點實驗室（試運行），武漢 430070）

克隆萬壽菊番茄紅素β-環(huán)化酶基因和其啟動子，進行生物學信息分析，并預測啟動子功能，為萬壽菊類胡蘿卜素的代謝機制和葉黃素含量的調控提供參考依據(jù)。通過RT-PCR技術從萬壽菊總RNA中克隆得到的cDNA序列；應用生物學方法分析其DNA序列及其編碼蛋白質序列特征，使用DNAMAN和在線軟件BoxShade對其氨基酸序列同源性比對分析，并利用MEGA6.0構建進化樹，分析其親緣關系；根據(jù)其cDNA序列利用FPNI-PCR法克隆其啟動子序列，利用PlantCare在線數(shù)據(jù)庫分析萬壽菊啟動子調控元件，構建啟動子缺失表達載體pTeLCYb（-1969）∷GUS和pTeLCYb（-1140）∷GUS，利用農桿菌介導法侵染煙草，以為報告基因研究不同調控元件的活性。從萬壽菊中成功克隆，生物信息學分析發(fā)現(xiàn)，其全長共1 865 bp，開放閱讀框為1 527 bp，編碼508個氨基酸，氨基酸序列同源比對結果表明其與西洋蒲公英和菊花的同源性最高，且具有LCYb蛋白質特有的保守功能位點和特征多肽序列，在進化上與菊科單獨聚為一枝。在已知基因序列的基礎上獲得長度為1 806 bp的啟動子序列，生物學信息分析表明：該啟動子除包含核心啟動子元件TATA-box、CAAT-box外，還含有多種光應答元件和激素響應元件，其中光響應元件有13個，激素響應元件有5個，此外還具有MYBHv1 結合位點元件、耐熱響應元件、生理調控作用元件等順式調控元件。GUS化學組織染色結果顯示不同長度啟動子均能夠驅動在莖、葉、花藥及柱頭中表達，但不同組織GUS染色藍色斑點深度不同，其中花器官中花藥和柱頭中GUS酶活性最強；相對于啟動子pTeLCYb（-1969），pTeLCYb（-1140）啟動子還能夠驅動在根、葉和花萼中特異性表達，且各組織中GUS酶活性明顯強于啟動子pTeLCYb（-1969）的GUS化學組織染色結果。不同長度啟動子均能驅動下游的表達，但啟動子的作用部位和作用強度存在差異，推測在ATG上游1 140 bp和164 bp區(qū)間的光響應元件可能具有增強子的功能，而全長啟動子特有的激素響應元件和熱響應元件可能具有抑制或降低啟動子功能的作用。

萬壽菊；番茄紅素β-環(huán)化酶基因；啟動子；啟動子功能分析

0 引言

【研究意義】萬壽菊為菊科萬壽菊屬植物,萬壽菊是提取類胡蘿卜色素的優(yōu)質植物源材料[1]，其中葉黃素是主要色素成分，約占萬壽菊所含類胡蘿卜素總量的90%[2]。番茄紅素β-環(huán)化酶是類胡蘿卜素合成途徑中的關鍵酶，是調控番茄紅素向葉黃素分化的限速酶，因此克隆并探索能夠驅動萬壽菊番茄紅素β-環(huán)化酶高效轉錄的番茄紅素β-環(huán)化酶啟動子，對于提高萬壽菊體內葉黃素含量的研究有重大意義。【前人研究進展】類胡蘿卜素是由異戊二烯途徑合成的一類自然界廣泛存在的有色物質，呈現(xiàn)橙紅色、橙色和黃色的一類萜類物質[3]，約有10%的類胡蘿卜素是維生素A的前體，具有抗癌、預防癌癥等多種疾病的作用，是人和動物食物中不可缺少的成分[4-7]。目前有關植物類胡蘿卜素生物合成途徑的研究很多，參與其代謝的酶主要有八氫番茄紅素合成酶（PSY）、八氫番茄紅素脫氫酶（PDS）、ξ-胡蘿卜素脫氫酶（ZDS）、番茄紅素β-環(huán)化酶（LCYb）和番茄紅素ε-環(huán)化酶(LCYe)等。其中番茄紅素β-環(huán)化酶（LCYb）是類胡蘿卜素合成途徑的關鍵酶，其基因的轉錄水平會影響上游番茄紅素和下游β-胡蘿卜素、葉黃素等產(chǎn)物的積累。Moreno等[8]發(fā)現(xiàn)超量表達的胡蘿卜株系中能顯著提高β-胡蘿卜素的積累量，沉默時會降低β-胡蘿卜素的含量；紅肉番木瓜是由于野生型番木瓜有色體中特有的番茄紅素β-環(huán)化酶基因功能缺失導致番茄紅素的積累產(chǎn)生的[9-11]。從番茄品種中克隆得到兩種番茄紅素β-環(huán)化酶基因，分別為和，研究發(fā)現(xiàn)紅色果肉番茄與淺色果實的番茄相比，兩個基因的表達量逐漸降低隨著果實的成熟，但紅色果肉上游番茄紅素積累量顯著高于淺色果實的番茄[12]。柑橘中表達量下調會導致番茄紅素的積累[13-15]，將RANi干涉載體導入到白心紅薯植株體中，發(fā)現(xiàn)轉基因植株的紅薯內部變成了橘紅色[16]。因此，番茄紅素環(huán)化酶在參與類胡蘿卜素組分調節(jié)中起著重要的作用。前人通過同源克隆的方法已經(jīng)獲得了萬壽菊舌狀花（花瓣）中類胡蘿卜素生物合成途徑中各種關鍵酶基因，葉黃素的合成需要多種酶的催化，在萬壽菊中葉黃素的合成積累與有密切關系[1, 17]。【本研究切入點】本研究利用RT-PCR的方法從萬壽菊花中克隆獲得一條同源基因，命名為，前人研究表明萬壽菊中葉黃素合成可能與同源基因的調控機制直接相關[18]，而關于萬壽菊的啟動子研究未見報道。【擬解決的關鍵問題】本研究在序列的基礎上利用FPNI-PCR法克隆啟動子序列，并利用在線軟件預測該基因啟動子區(qū)域的順式作用調控元件，構建啟動子缺失表達載體，異源轉化模式植物煙草，通過GUS化學組織染色明確的表達部位和預測啟動子順式作用元件功能，為進一步研究的轉錄調控奠定基礎。

1 材料與方法

試驗于2014年7月至2016年12在華中農業(yè)大學進行。

1.1 材料

2014年7月中旬將萬壽菊‘貴婦人’（色素品種）播種于128孔穴盤中，待幼苗長出2—3對真葉時移栽于直徑為21 cm的素燒瓦盆，并擺放于基地露天廣場（位于北緯30°28′36.5″，東經(jīng)114°21′59.4″），常規(guī)栽培。待苗長到5—6對真葉時，采集健康的幼葉留作DNA的提取，九月下旬采集全開時期的整朵花于液氮中速凍并保存于-80℃超低溫冰箱備用。

轉化所用煙草為導入了外源玫瑰的品種，表現(xiàn)為比正常煙草早開花的性狀[19]。

1.2 試驗方法

1.2.1 萬壽菊番茄紅素β-環(huán)化酶基因的克隆 利用Trizol試劑盒法（Invitrogen，California，The United States）提取萬壽菊全開時期的花器官總RNA，利用反轉錄試劑盒 PrimerScript? RT reagent Kit with gDNA Eraser（TaKaRa，大連，中國）將RNA反轉錄成單鏈cDNA，并用萬壽菊的看家基因β-actin檢測反轉錄效果。從筆者課題組測定的萬壽菊轉錄組數(shù)據(jù)庫（序列號：SRP066084）中調取序列，根據(jù)序列的UTR區(qū)設計的上下游引物-F/ -R（表1）。PCR反應程序為：94℃預變性4 min；94℃變性30 s，60℃退火30 s，72℃延伸2 min，36個循環(huán)；總延伸10 min。PCR產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測后對目的片段在紫外線下進行切膠回收，將純化后的產(chǎn)物與PMD-18T載體連接，再經(jīng)過熱激轉入大腸桿菌DH5α感受態(tài)細胞中，菌落PCR檢測后將陽性克隆送生工生物工程（上海）股份有限公司測序。

利用DNAMAN和在線軟件BoxShade（https:// embnet.vital-it.ch/software/BOX_form.html）分析萬壽菊的生物學信息。

1.2.2 番茄紅素β-環(huán)化酶基因啟動子序列克隆和其生物信息學信息分析 以幼葉為材料，采用改良的CTAB法[20]提取萬壽菊總DNA。根據(jù)上述序列測序結果，利用FPNI-PCR法克隆啟動子，設計3個嵌套式的特異引物SPb1-1R、SPb1-2R、SPb1-3R（表1），3輪反應程序具體參照WANG等[21]方法，在第三輪中發(fā)現(xiàn)一條特異條帶，經(jīng)切膠回收、熱激連接T載體，陽性菌落檢測，送樣測序。采用同樣的FPNI-PCR法，以第一次啟動子測序結果為模板設計3個嵌套式的特異引物SPb2-1R、SPb2-2R、SPb2-3R（表1），最后根據(jù)兩次啟動子序列拼接結果分別在距離ATG上游1 945 bp和164 bp處設計擴增全長啟動子上下游引物，命名為pTeLCYb-F（-1945）和pTeLCYbF（-164）（表1），PCR擴增程序體系及后續(xù)測序具體步驟參照1.2.1。

利用PlantCare（http://bioinformatics.psb.ugent. be/webtools/plantcare/html/）在線數(shù)據(jù)庫分析萬壽菊啟動子調控元件。啟動子序列生物信息學分析發(fā)現(xiàn)在ATG上游1 140 bp和164 bp區(qū)間有大量的光響應元件，而在ATG上游1 969 bp和1 140 bp區(qū)間主要是激素響應元件和耐熱響應元件，為尋找具有增強啟動子功能的的作用元件，對啟動子序列進行缺失克隆，因此在ATG上游1 117 bp處設計引物pTeLCYb-F（-1117）（表1）。

1.2.3 植物表達載體的構建和農桿菌的轉化 利用Gateway技術分別構建不同長度啟動子的表達載體，分別命名為：pTeLCYb（-1969）∷GUS和pTeLCYb（-1140）∷GUS（數(shù)字為距離ATG上游的堿基長度）。用RⅠ和Ⅰ分別雙酶切含有目的片段克隆載體PMD-18T和中間載體V097，分別回收酶切產(chǎn)物后進行連接，將連接液用熱激法導入到DH5α大腸桿菌中，檢測陽性菌落提取質粒，再通過Getway技術將目的片段重組到含有報告基因的V152表達載體上，LR反應采用5.0 μL的反應體系：入門克隆載體V097 1.0 μL（75 ng），表達載體V152 1.0 μL（75 ng），LR clonase enzyme mix 1.0 μL，TE溶液補充到5.0 μL。25℃反應12 h后，加入2.0 μL Proteinase K（蛋白酶K）solution，37℃溫浴10 min，終止LR，反應液轉化大腸桿菌DH5α感受態(tài)細胞中，挑菌落檢測陽性，提取陽性菌落質粒，分別命名為V152-PTeLCYb（-1969）和V152-PTeLCYb（-1140）。各取1.0 μL陽性質粒經(jīng)電轉分別導入GV3101農桿菌感受態(tài)中，將轉化細胞均勻涂布含100 mg?L-1壯觀霉素固體LB培養(yǎng)基上28℃暗培養(yǎng)2 d，以特異引物pTeLCYb-F（-1945）、pTeLCYb-F（-1117）和載體引物V152-R做陽性菌落PCR檢測，挑取陽性菌落于相同濃度壯觀霉素LB培養(yǎng)基內28℃震蕩暗培養(yǎng)2 d，隨后采用葉盤轉化法轉化早花煙草，具體轉化方法參考HORSCH等[22]。

表1 引物序列

1.2.4 陽性苗的檢測 采用SDS磁珠法[23]分別提取轉化不同長度啟動子的抗性煙草葉片的DNA，用特異引物pTeLCYb-F（-1945）、pTeLCYb-F（-1117）和載體引物V152-R對所提取的DNA做PCR檢測。PCR擴增反應體系：PCR-Mix 12.5 μL，上、下游引物各1.0 μL，DNA模板1.0 μL，加去離子水補充到25 μL（Aidlab，北京，中國）。反應程序：95℃預變性4 min；95℃變性30 s，58℃退火 30 s，72℃延伸2 min，36個循環(huán)；72℃總延伸10 min，4℃保溫10 min。PCR產(chǎn)物經(jīng)1% 瓊脂糖凝膠電泳檢測，統(tǒng)計陽性植株數(shù)。

1.2.5 轉基因煙草GUS化學組織染色 采集PCR檢測陽性植株幼苗和花器官進行GUS化學組織染色，以未轉化煙草作為陰性對照。GUS化學組織染色具體步驟參考JEFFERSON等[24]。

2 結果

2.1 萬壽菊番茄紅素β-環(huán)化酶基因獲得和序列分析

根據(jù)已有的基因轉錄組數(shù)據(jù)設計擴增引物，測序結果發(fā)現(xiàn)萬壽菊cDNA全長為1 865 bp，最大開放閱讀框（Open Reading Frame，ORF）為1 527 bp，編碼508個氨基酸殘基。利用DNAMAN和BoxShade軟件同源性比對分析發(fā)現(xiàn)該核苷酸序列推導的氨基酸序列與同科的西洋蒲公英（BAE79544.1）菊花（BAE79544.1）、刺苞菜薊var.（KVI03465.1）的同源性分別為87.20%、85.10%、81.56%。對其氨基酸結構分析發(fā)現(xiàn)，TeLCYb氨基酸序列含有典型LCYb氨基酸結構如：β-lcyb保守域、LCY特異元件、β-lcyb CAD等（圖1）。

為探討萬壽菊與菊科中其他植物之間的關系，并進一步探討與其他物種之間的系統(tǒng)進化關系，利用MEGA6.0構建含有13個LCYb氨基酸序列的進化樹，采用鄰近法1 000重復的自展檢驗完成。結果表明萬壽菊TeLCYb與菊科植物單獨聚為一個進化分枝，萬壽菊TeLCYb與菊花和甘菊的親緣關系較近，與刺苞菜薊var.的親緣關系較遠（圖2）。

2.2 萬壽菊TeLCYb啟動子克隆和順式元件預測

利用染色體步移技術FPNI-PCR方法對啟動子序列進行兩次克隆，第一次PCR擴增產(chǎn)物經(jīng)測序驗證為一條1 343 bp的長度的啟動子序列，采用同樣的方法在第一次序列的基礎上繼續(xù)向上游擴增獲得587 bp長度序列，經(jīng)兩次克隆拼接得到了ATG上游2 036 bp的序列。由于ATG上游區(qū)域包含基因5′非翻譯區(qū)，因此本研究克隆全長啟動子引物的下游引物設計在ATG上游164 bp處的位置，上游引物設計在ATG上游1 945 bp處的位置，最終獲得一條長1 806 bp含有核心元件的啟動子片段，命名為pTeLCYb（-1969）。

圖1 TeLCYb的氨基酸序列比對

括號內為該物種的LCYb氨基酸序列在GenBank中的登錄號，分支上面的數(shù)字采用1 000重復的自展檢驗生成Numbers in parentheses represent the sequences' accession number in GenBank. The number at each branch point is the percentage supported by 1 000 bootstrap

利用PlantCare在線分析軟件對啟動子序列進行生物信息學分析，結果（表2）顯示，該啟動子除了典型的TATA-box和CAAT-box核心啟動子元件外，還包含多種光應答元件、激素響應元件，值得注意的是該序列中有13個參與光應答及光調控的元件和5個參與激素響應的元件AuxRR-core、ARE、ERE等。另外，還有一些除了光響應元件和激素響應元件之外的其他環(huán)境響應元件的存在，如抗旱和高溫響應元件CCAAT-box、MBS、HSE，厭氧必需的順式元件ARE等。除了上述順式作用元件外，還發(fā)現(xiàn)4個胚乳表達所需要的元件（skn-1_motif）等。

通過以上對啟動子順式作用元件分析發(fā)現(xiàn)，光響應元件主要分布在ATG上游1 140 bp和164 bp區(qū)間，而在ATG上游1 969 bp和1 140 bp區(qū)間主要是激素響應元件（CGTCA-motif、ERE）和逆境脅迫響應元件（HSE），因此為了探究光響應元件以及激素響應元件（CGTCA-motif、ERE）和逆境脅迫響應元件（HSE）的特殊功能，設計上游引物TeLCYb（-1117）,通過PCR擴增獲得一條長度為977 bp的啟動子片段，命名為pTeLCYb（-1140）（圖3）。

表2 啟動子順式作用元件分析

1: pTeLCYb(-1140); 2: pTeLCYb(-1969)

2.3 轉化煙草陽性苗的檢測

PCR擴增檢測轉化苗葉片DNA，結果顯示21棵轉pTeLCYb（-1140）∷GUS的煙草植株中有16棵克隆出目的片段（圖4-A）；18棵轉 pTeLCYb（-1969）∷GUS的煙草植株中有15棵克隆出目的片段，其他3棵為假陽性苗（圖4-B）。

2.4 GUS植物組織染色

采集陽性苗和未轉化煙草的幼苗和整朵花進行GUS組織化學染色，結果顯示陰性對照組無任何藍色斑點出現(xiàn)；轉化pTeLCYb（-1969）∷GUS的陽性植株在莖、花瓣、花藥、柱頭部位檢測到的表達，而其根、葉片和花萼中均無藍色斑點；轉化pTeLCYb（-1140）∷GUS的陽性植株的根、莖、葉、花萼、花瓣、花藥以及柱頭均有藍色斑點出現(xiàn)，其中在花組織中，花藥和柱頭中GUS酶活性較花萼中強。不同長度啟動子GUS組織化學染色結果比較，轉化全長啟動子的陽性苗的組織藍色斑點顏色均淺于轉pTeLCYb（-1140）∷GUS組織染色結果，且在綠色組織中轉化pTeLCYb（-1969）∷GUS的陽性植株GUS不表達或表達水平很弱（圖5），說明克隆的啟動子能夠成功的驅動下游報告基因的表達，但不同長度的啟動子對下游基因的作用強度不同。

A：pTeLCYb（-1140）∷GUS；B：pTeLCYb（-1969）∷GUS。CK-：未轉化煙草；CK+：V152-PTeLCYb（-1140）/ V152-PTeLCYb（-1969）質粒；數(shù)字：轉基因煙草編號A: pTeLCYb(-1140)::GUS; B: pTeLCYb(-1969)::GUS. CK-: Non-transgenictobacco plants; CK+: V152-TeLCYb(-1140)/ V152-TeLCYb(-1969) plasmid; No: Transgenic tobacco plants number

圖5 GUS活性檢測

3 討論

番茄紅素β-環(huán)化酶是類胡蘿卜素生物合成途徑中的關鍵酶，是催化番茄紅素向下游合成路徑的重要分支點酶[25-26]。目前已在多種園藝作物中克隆出β-環(huán)化酶基因并對其功能進行了驗證，如榴蓮、紅薯、柑橘[16,27-28]。本研究利用RT-PCR的方法獲得了一條同源序列，采用生物信息學分析發(fā)現(xiàn)，該基因推導的氨基酸序列具有LCYb蛋白質特有的保守功能位點和特征多肽序列，同源序列比對和進化樹分析均表明其與菊科植物同源性最高，進化關系最近，說明菊科植物在進化上是相對保守的。

目前雖然在許多植物中已經(jīng)被成功分離并進行了相應的功能驗證，對于調控這些關鍵酶基因的啟動子研究多是集中在經(jīng)濟作物[29-31]，而對花卉植物啟動子的研究除龍膽[32]外卻鮮有報道。植物啟動子在調控基因表達過程中起關鍵作用，本研究克隆得到了一條長度為1 806 bp的啟動子序列，發(fā)現(xiàn)該啟動子含有多種生物學順式作用元件，推測的轉錄水平可能受到多種因素的調控。pTeLCYb（-1969）序列中含有多個光應答和參與光調控的元件，如：Box-I、I-box、Box-4、ACE、G-box等。YANG等[33]研究發(fā)現(xiàn)光響應元件Box-I、G-boxes、GAG motif、Box-4和chs-CMA1a等通過調節(jié)日長和其他刺激途徑調控花發(fā)育過程中胡蘿卜素的合成，另外早期的其他研究報道也發(fā)現(xiàn)胡蘿卜色素的合成受光的調控[34-35]，暗示萬壽菊中的表達同樣受光信號的調控。相比西瓜、柑橘、杧果啟動子序列分析結果[30-31,36]，萬壽菊具有較多的且獨有的光響應元件，如：chs-CMA1a、BOX-4、BOX-I，推測光信號調控在調節(jié)表達中具有主導作用。除了光應答元件，該啟動子序列還包含多個參與激素響應的順式作用元件，其中WISUTIAMONKUL等[28]研究發(fā)現(xiàn)內源乙烯調控榴蓮的表達水平，推測的轉錄水平與激素的調節(jié)有關。除以上順式作用元件外，該序列中還包含MYBHv1結合位點元件、耐熱響應元件等非生物脅迫響應元件，暗示可能提高植物對非生物脅迫的耐受能力[16]。另外該序列還包含一些生理調控作用元件，如：ARE、Skn-1_motif，進一步說明的表達還可能受到生理因素的調控。

對轉化pTeLCYb（-1969）啟動子的轉基因煙草陽性苗進行GUS化學組織染色，結果說明該啟動子具有啟動下游基因表達的功能，但在不同組織中啟動子的作用強度不同，也進一步說明該啟動子具有組織的特異性，同時也印證了在植物體內的廣泛表達，這與前人[1,17]對萬壽菊研究結果較為一致，不同之處是萬壽菊花瓣中表達量最高，此差異可能是不同物種調控路徑不同所導致，猜測葉黃素積累量高的植物組織表達量高。

由轉化不同長度啟動子的轉基因煙草GUS植物組織染色結果的差異，推測pTeLCYb（-1140）啟動子中的光響應元件可能具有增強下游基因在綠色組織中表達的作用，而pTeLCYb（-1969）啟動子中的激素響應元件（CGTCA-motif、ERE）以及逆境脅迫響應元件（HSE）可能具有抑制作用；另外在花的組織染色中同樣有較明顯的差異，該區(qū)段啟動子對下游表達水平的正向調控能力明顯大于pTeLCYb（-1969）啟動子的調控作用，推測光響應元件可能具有增強子的功能。相關研究發(fā)現(xiàn)光響應元件Box-I、G-boxes、GAG motif、Box-4等通過調節(jié)日長和其他刺激途徑調控花發(fā)育過程中胡蘿卜素的合成[33]；另外，早前的其他研究報道中也發(fā)現(xiàn)胡蘿卜色素的合成受光的調控[34-35]，這些報道更加證明了光響應元件具有正調控的表達。激素和逆境響應元件相關報道發(fā)現(xiàn)茉莉酸能夠促進番茄紅素在果實中的積累[37]，乙烯響應元件ERE在橘柑有色體特有的啟動子中能夠調節(jié)果實的成熟[27]，而果實的成熟和番茄紅素的積累有關[34-35]，猜測這些激素響應元件在萬壽菊中通過抑制或減弱啟動子的功能來降低的表達量，從而提高植株體內番茄紅素的積累。關于HSE熱響應元件在類胡蘿卜素合成途徑中的作用目前尚不清楚，根據(jù)本研究的結果推測其同樣可能具有抑制或減弱啟動子驅動下游基因表達的功能。因此針對本試驗不同啟動子作用下的GUS化學組織染色差異，推測光響應元件在調控下游基因的表達上具有主導作用且扮演著增強子的角色，而部分激素和逆境響應元件可能具有部分抑制子的功能。

4 結論

本研究利用RT-PCR的方法從萬壽菊花中獲得一條同源基因，生物信息學分析發(fā)現(xiàn)該基因推導的氨基酸序列具有典型的LCYb蛋白質特有的保守功能位點和特征多肽序列，同源序列比對和進化樹分析均表明其和菊科植物同源性最高，進化關系最近。啟動子順式作用元件預測分析發(fā)現(xiàn)該啟動子含有多種光響應元件、激素響應元件及逆境響應元件等。構建該啟動子缺失表達載體，異源轉化模式植物煙草，GUS化學組織染色結果顯示不同長度的啟動子均能驅動下游基因的表達，但GUS酶活性強度和表達部位存在差異，推測在ATG上游1 140 bp和164 bp區(qū)間的光響應元件可能具有增強子的功能，而全長啟動子特有的激素響應元件和熱響應元件可能具有抑制或降低啟動子功能的作用。

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（責任編輯 趙伶俐）

Cloning and Functional analysis of lycopene β-cyclase promoter of marigold ()

ZHANG ChunLing, WANG NiHui, WANG NingLe, Bao ManZhu, HE YanHong

(College of Horticulture and Forestry Sciences, Huazhong Agricultural University/Key Laboratory of Horticultural Plant Biology, Ministry of Education/Key Laboratory of Urban Agriculture in Central China (pilot run), Ministry of Agriculture, Wuhan 430070)

The objective of this study is to clone Lycopene β-cyclase enzyme() gene and its promoter from marigold(), to analyze their bioinformatics characters and predict the promoter function. This study provides a reference for the regulation of the metabolic mechanism of the carotenoids and the control of the lutein concentration in marigold.The cDNA sequence ofgene was cloned using RT-PCR method. Bioinformatics tools were applied to analyze both thegene sequence and the characteristics of its encoded protein sequence. DNAMAN and online software BoxShade were used to make multiple sequence alignments between the TeLCYb amino acid sequence and their homologous sequences, and MEGA6.0 was used to constructed phylogenetic tree of homologous species. The promoter sequence was cloned according to its cDNA sequence using FPNI-PCR. Thereafter, two different 5′ UTR deletion mutants of thegene promoter were amplified by PCR, and then were inserted into the vector V152 to construct promoter-fusion genes expression vectors, named pTeLCYb(-1969)::GUS and pTeLCYb(-1140)::GUS, respectively, and then were transformed into tobacco by atumefaciens-of trespectively. And the promoter activities were quantitatively estimated usingreport gene.Thewas successfully cloned from marigold(). The bioinformatics analysis showed that its full length was 1 865 bp with an open reading frame (ORF) of 1 527 bp length, encoding 508 amino acids. Homology analysis showed that the deduced TeLCYb protein was highly homologous to other LCYb proteins from,and TeLCYb protein has typical protein special elements of LCYb protein. Phylogenetic analysis also indicated that TeLCYbwas clustered into the branch with asteracea. A 1 806 bp promoter sequencewas obtained via FPNI-PCR. Bioinformatics analysis of promoter sequence revealed that this fragment contained some promoter core elements, such as TATA-box and CAAT-box, and 13 light responsive elements and 5 hormones responses elements. Meanwhile, MYB transcription factor binding elements and heat-resistant response elements, physiological control elements and cis-acting regulatory elements were found in this sequence. Functional characterization of promoters by constructing pTeLCYb (-1969)::GUSand pTeLCYb (-1140)::GUS plant expression vectors and transforming into tobacco respectively showed that both promoters were active in stems, petals, anthers and capitals. But there were significant differences of GUS enzyme activity among plant tissues, and blue spots found in anthers and capital were significantly stronger than that of petals. Compared with the expression level of pTeLCYb (-1969)::GUS, the shorter sequence of pTeLCYb (-1140) led to a significant increase in the activity of GUS in the transgenic leaves and root and sepals were also found GUS enzyme activity.Different length of promoters can drive the expression ofgene, but there are differences in the sites and intensity where promoters functions, we hypothesize that a positive regulatory factor of light response elements maybe exist between 1 140 bp and 164 bp area of 5′ upstream to ATG, while hormone response elements and the heat stress response element may suppress or reduce the promoter function.

marigold(); lycopene β-cyclase; promoter clone; analysis of promoter function

2017-06-12；

2017-10-12

國家自然科學基金（31672181）

張春玲，E-mail：1664507613@qq.com。

何燕紅，E-mail：hyh2010@mail.hzau.edu.cn