基于單鏈置換的環介導間接PCR鑒別PEDV、TGEV方法的建立及應用

鄭鳴，李華瑋，劉瑩瑩，王永芬，邊傳周，郭宏偉

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基于單鏈置換的環介導間接PCR鑒別PEDV、TGEV方法的建立及應用

鄭鳴，李華瑋，劉瑩瑩，王永芬，邊傳周，郭宏偉

（河南牧業經濟學院，鄭州 450046）

豬病毒性腹瀉主要是由豬流行性腹瀉病毒（PEDV）和豬傳染性胃腸炎病毒（TGEV） 所引起的一種急性腸道傳染病，臨床上以嘔吐、腹瀉、脫水、高發病率和死亡率為主要特征。PEDV與 TGEV同屬α冠狀病毒，可以感染各年齡段豬只，尤其對仔豬的危害最為嚴重，可導致大量仔豬死亡，給養殖業造成嚴重經濟損失。由于PEDV和TGEV感染在臨床癥狀、病理變化和流行病學上極為相似，臨床上很難區分，因此，建立一種高效、特異的臨床鑒別診斷方法對于預防病毒性腹瀉的爆發流行具有重要意義。本試驗旨在建立豬流行性腹瀉病毒（PEDV）和豬傳染性胃腸炎病毒(TGEV）環介導間接PCR檢測方法，用于豬病毒性腹瀉的病原學鑒別診斷。根據GenBank數據庫中PEDV和TGEV基因組序列信息，在對兩種病毒基因序列同源性比較的基礎上，分別選取PEDV和TGEV核蛋白（N）基因序列的一段高度保守區，設計兩條序列相鄰的特異性探針，標記于不同大小的基因片段兩端，作為特異性標記的報告基因。此報告基因與待測靶標基因經雜交、環化后，采用1對引物反向PCR擴增報告基因，建立PEDV/TGEV鑒別診斷方法，擴增片段大小分別為404、252bp。該方法特異性好，可單獨或同時檢測PEDV和TGEV，與豬圓環病毒2型（PCV2）、豬A型輪狀病毒（RAV）、豬繁殖與呼吸綜合征病毒（PRRSV）、豬瘟病毒（CSFV）、豬偽狂犬病毒（PRV）和豬細小病毒（PPV）等常見豬源性病毒無交叉擴增；檢測靈敏度高，對PEDV和TGEV的最低極限濃度分別為1.6和8 pg·μL-1的核酸樣品，兩種病原的同時檢測不影響檢測靈敏度；采用環介導間接PCR、常規RT-PCR和SybrGreen實時PCR對157份臨床樣本進行比較檢測，3種方法的PEDV檢出率分別為33.76%、21.66%和36.31%，TGEV檢出率分別為26.75%、13.38%和28.03%；kappa檢驗結果，環介導間接PCR、SybrGreen實時PCR兩種方法對PEDV和TGEV檢測結果的符合度均為96.18%（κ≥0.90）環介導間接PCR可以用于鑒別診斷PEDV/TGEV，是一種快速、準確、靈敏、特異的病原學診斷工具。

豬流行性腹瀉病毒（PEDV）；豬傳染性胃腸炎病毒(TGEV）；環介導間接PCR；探針；報告基因

0 引言

【研究意義】以水樣腹瀉、嘔吐、消瘦等為主要臨床癥狀的傳染性仔豬腹瀉是一種高度接觸性腸道傳染病，是引起哺乳仔豬死亡和發育不良的重要因素，也是威脅生豬養殖業健康發展主要疾病之一[1-2]，流行趨勢逐年走高。流行病學調查顯示，豬流行性腹瀉病毒（PEDV）和傳染性胃腸炎病毒（TGEV）是引起傳染性仔豬腹瀉的2種主要腸道病原，尤其是PEDV，因其發病率和死亡率高而廣受關注[3-4]。近年來，傳染性仔豬腹瀉不僅在中國、韓國和日本等亞洲國家暴發流行[5-7]，加拿大、德國、美國等歐美國家也面臨嚴峻形勢，僅2013—2014年間，美國就因暴發腹瀉而導致800萬仔豬死亡，直接經濟損失達數億美元[8-9]。傳染性仔豬腹瀉正在成為危害世界養豬業的主要疾病之一。【前人研究進展】PEDV和TGEV同屬于α冠狀病毒屬，是一種具有囊膜的球形、單股正鏈RNA病毒[10]。成熟病毒粒子的囊膜中含有纖突蛋白S、膜蛋白M和包膜蛋白E三種主要結構蛋白，在病毒囊膜形成、出芽和分泌過程中發揮重要的協同作用[11]。由于冠狀病毒基因組獨特的套式轉錄機制使其在自然進化中非常容易發生基因變異，從而不斷產生新的變種，甚至引起新的傳染性疾病，如豬呼吸道冠狀病毒（porcine respiratory coronavirus，PRCoV）即是TGEV的自然缺失突變體[12-13]；而不同來源的PEDV野毒株，其S 基因存在大量堿基的刪減、插入或缺失等突變現象，主要發生在S蛋白的N端區域，對病毒毒力有重要影響[14-16]。PEDV和TGEV主要通過糞-口途徑傳播，可在世界范圍內感染各年齡段豬只而引起腸道疾病，因PEDV感染的臨床癥狀、致病機理和病理變化與TGEV感染極為相似，且兩種病毒通常存在混合感染、協同致病現象[17-18]，給傳染性仔豬腹瀉的診斷和預防帶來困難，在臨床上建立一種特異、高效、敏感的鑒別檢測 PEDV、TGEV兩種病毒的方法對疾病防控具有重要意義。由于流行性腹瀉病毒和傳染性胃腸炎病毒引起傳染性仔豬腹瀉臨床癥狀和病理組織變化極為相似，必須借助于實驗室方法才能進行鑒別檢測。目前常用的實驗室鑒別診斷技術主要有微量血清中和試驗、酶聯免疫吸附試驗（ELISA）、免疫組織化學等免疫學診斷技術和原位雜交、PCR等分子診斷技術[19-20]。免疫診斷時間短，操作方便，但由于PEDV、TGEV的抗原變異及交叉反應導致免疫診斷靈敏度和特異性都比較低，不利于及時準確地對豬腹瀉病因進行調查和監測；分子診斷則因其高度特異性和敏感性而受到廣泛關注，尤其是以PCR擴增為基礎的RT-PCR[21]、Real-Time PCR[22]、多重PCR[23]和環介導等溫擴增（LAMP）[24]等，在豬繁殖與呼吸綜合征病毒（PRRSV）、豬瘟病毒（CSFV）、豬偽狂犬病毒（PRV）、PEDV等眾多豬源性病毒的臨床診斷中得到初步應用。【本研究切入點】盡管PCR是一種特異、敏感、簡便、快速的分子診斷技術，但由于PCR指數擴增極易放大因樣本、加樣及氣溶膠等因素引起的交叉污染而導致假陽性，而且對于不新鮮樣本，存在因目的基因降解、中間斷裂等原因而擴增不出的假陰性問題，假陽性和假陰性率偏高限制了其在臨床診斷上的應用。針對PCR檢測存在的問題，作者建立了基于單鏈置換的PCR檢測技術[25]，初步應用于PRRSV、CSFV 和豬圓環病毒2型（PCV2）等豬源性病毒的檢測[26]和食源性單增李斯特菌的檢測[27]，并取得了良好效果，但由于檢測探針設計的缺陷，導致臨床應用效果并不理想，尤其是RNA病毒檢測，漏檢現象嚴重。【擬解決的關鍵問題】本研究中，主要根據PEDV和TGEV核蛋白基因（N）的高度保守型，以及PEDV和TGEV 兩種病毒間N基因序列的差異性，優化探針設計方案，建立PEDV/TGEV環介導間接PCR快速鑒別診斷技術，為及時準確地對豬病毒性腹瀉進行調查和監測提供有效工具。

1 材料與方法

試驗于2016年8月至2017年7月在河南牧業經濟學院生物技術實驗室完成。

1.1 毒株、試驗病料及主要試劑

試驗所用PEDV、TGEV野毒株、PCV2野毒株、豬A型輪狀病毒（porcine group A rotavirus，RAV）由河南牧業經濟學院大成動物研究院分離保存；PRRSV和CSFV活疫苗毒株購自洛陽萊普生信息技術有限公司；PRV、豬細小病毒（porcine parvovirus，PPV）購自中國獸藥監察所；含有擬南芥TOC1基因（NM_125531.3）的重組質粒pMD18-T-由河南牧業經濟學院生物技術實驗室構建保存；Trizol試劑購自美國Invitrogen Corporation，Taq DNA Ligase購自英國NEB；Pfu DNA Polymerase、RNase Inhibitor和DL-2000購自寶生物工程（大連）有限公司。試驗用157份疑似豬傳染性胃腸炎和流行性腹瀉病毒感染豬的腸內容物和腸黏膜樣品由河南牧業經濟學院大成動物研究院收集自鄭州周邊縣市養殖場，所有樣本均置于-80℃凍存。

1.2 雙探針設計及引物合成

以GenBank 收錄的PEDV CV777株（DQ355221.1）和TGEV HN株（AY587884.1）N基因序列為參考，采用 Blastn 比對分析PEDV和TGEV N基因序列的保守性，分別選取PEDV和TGEV N基因一段長度為40—50bp保守區為雜交探針，將探針序列均分為左右兩部分（L Probe和R Probe）形成雙探針，分別標記擬南芥TOC1基因即獲得標記的報告基因，試驗中用到的探針、標記引物及反向PCR擴增引物均利用Primer Premier 5.0軟件設計，由上海生工合成，序列見表1。

表1 標記引物和檢測引物序列及特性

a引物的5′端進行磷酸化修飾；劃線部分為探針序列；b基因為PEDV CV777株N基因（DQ355221.1）和TGEV HN株N基因（AY587884.1）

aThe 5′ ends of primers were phosphorylated; The lined sequences of primers were probes.bThe N gene of PEDV strain CV777 (DQ355221.1) and the N gene of TGEV strain HN（AY587884.1）

1.3 核酸的分離

試驗樣本基因組DNA按參考文獻[19]的方法分離提純；樣本（組織細胞、病料）總RNA則采用Trizol試劑一步法制備：取100mg組織/107細胞，加入1mL Trizol試劑，用力振蕩后；加入100 μL氯仿，振蕩；12 000 r/min離心10min后取上清；加入等體積異丙醇，置-20℃沉淀2h；12 000 r/min離心5min后棄上清；75%冷乙醇洗滌沉淀1次，再加入30μL RNase-free H2O溶解，-80℃保存備用。

1.4 探針標記報告基因

采用常規PCR制備特異性探針標記的報告基因，分別以P1和P2、P3和P4為引物對，以重組質粒pMD18-T-為模板，擴增擬南芥TOC1基因片段，反應體系：10×Pfu Buffer 10 μL，dNTP（2.5mmol·L-1）8 μL，上下游引物（10μmol·L-1）各3 μL，pMD18-T-質粒2μL，Pfu DNA Polymerase（5U·μL-1）0.5 μL，加水補足100μL；擴增條件：94℃變性30s，60℃退火30s，72℃延伸30s，35個循環。瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR擴增產物，并進行回收純化，獲得針對PEDV 和TGEV病毒 N基因的、特異性探針耦聯的報告基因，經克隆測序驗證后-20℃保存備用。

1.5 一步環介導間接PCR鑒別試驗

采用一步法在PCR反應管中進行單鏈置換、環化和反向PCR擴增，反應體系：10×Pfu Buffer 3μL，10 ×Taq DNA Ligase Reaction Buffer 3μL，RNase Inhibitor 0.5μL，Pfu DNA Polymerase（5U·μL-1）0.5 μL，Taq DNA Ligase 0.5 μL，dNTPs（各10mmol·L-1）1 μL，RNA溶液 2μL，兩種特異性探針標記的報告基因各2μL，反向PCR引物 P5、P6（10μmol·L-1）各1μL，加入RNase-free H2O補足30μL；反應條件：95℃預變性5 min；95℃ 30s，53℃ 3min，10個循環； 95℃ 50s，53℃ 50s，72℃ 50s，25個循環。擴增產物經2%瓊脂糖凝膠電泳檢測，切膠回收特異性條帶，T/A克隆后挑選陽性克隆送生工生物工程（上海）股份有限公司進行測序。

1.6 特異性試驗

分別以PEDV和TGEV混合物、以及PEDV、TGEV、PCV2、RAV、PRRSV、CSFV、PRV和PPV的核酸樣品為模板，采用方法1.5的反應體系及循環條件進行環介導間接PCR擴增，觀察交叉反應情況，依此評估該檢測方法的特異性。

1.7 靈敏度試驗

將制備的PEDV和TGEV病毒核酸溶液用分光光度計進行濃度測定后，用RNase-free H2O調整RNA濃度至1 000 pg·μL-1，然后進行5倍倍比稀釋，形成1 000、200、40、8、1.6和0.32 pg·μL-16個濃度梯度，分別進行PEDV、TGEV和PEDV+TGEV環介導間接PCR，并計算環介導間接PCR擴增能夠檢測到的核酸最低濃度，評估該檢測方法的靈敏度。

1.8 臨床樣品檢測

研究中用到的157份具有腹瀉癥狀的病料，由河南牧業經濟學院大成動物研究院采集自鄭州市周邊地區不同豬場，主要包括糞便和腸道組織，按方法1.3制備病料總RNA。分別采用環介導間接PCR、常規RT-PCR和SybrGreen實時PCR 3種方法進行PEDV和TGEV檢測，觀察感染情況，比較3種方法的陽性檢出率，同時采用Kappa檢驗方法，比較分析環介導間接PCR和SybrGreen實時PCR檢測結果的一致性。統計分析軟件為SPSS13.0。

2 結果

2.1 探針標記報告基因

以重組質粒pMD18-T-為模板，分別以引物P1和P2、P3和P4進行常規PCR擴增，以實現將引物攜帶的特異性L probe和 R probe與報告基因的耦聯，其中用于PEDV檢測的報告基因長度為404bp，TGEV報告基因252bp。電泳檢測PCR產物，分別在250和500bp附近可見的清晰條帶（圖1），與預期片段大小一致；PCR產物經克隆測序后發現2個片段中間序列為擬南芥TOC1基因片段，而兩端則為標記的、不同的特異性探針序列，與設想完全一致。

M: DNA分子量標記DL2000；1:陰性對照；2，3：用TGEV和PEDV探針標記的報告基因

2.2 一步環介導間接PCR鑒別試驗

分別以PEDV、TGEV和PEDV+TGEV 的RNA溶液為模板，采用方法1.5 進行一步環介導間接PCR擴增，根據探針和引物設計情況，PEDV擴增條帶預期大小404bp，TGEV擴增條帶預期大小為252bp。將上述PCR擴增產物進行電泳檢測，結果如圖2所示，PEDV和TGEV各有1條清晰特異性擴增條帶，且與預期大小相一致，而PEDV和TGEV核酸混合樣品則出現2條特異條帶，且與PEDV和TGEV擴增條帶大小一致；將上述2條特異性條帶進行克隆測序，結果顯示，大片段序列中含有一段長度為44bp PEDV N基因序列，小片段含有42bp TGEV N基因序列，且兩個片段的兩側均為擬南芥TOC1基因片段，與設想完全一致。

2.3 特異性試驗

以方法1.5循環體系及條件，對PEDV、TGEV和PEDV+TGEV病毒核酸進行一步環介導間接PCR擴增，均可獲得特異性目的條帶，PEDV 404 bp，TGEV 252 bp；但正常的PCV2、RAV、PRRSV、CSFV、PRV和PPV等病毒核酸樣品則未能擴增出任何條帶（圖3），表明該方法特異性好，與其它病原無交叉反應。

M: DNA分子量標記DL2000；1:陰性對照；2：TGEV；3：PEDV；4：TGEV+PEDV

2.4 靈敏度試驗

敏感度試驗結果（圖4）表明，PEDV核酸樣品的6個濃度梯度中，僅有0.32 pg·μL-1無法擴增任何條帶，其余濃度的核酸樣品均有特異性擴增，而TGEV核酸樣品的6個濃度梯度中有兩個無法擴增，且條帶亮度隨核酸濃度的增加而增加；若將兩種病毒核酸混合后，不影響檢測的靈敏度。結果表明所建立的PEDV、TGEV環介導間接PCR檢測方法可檢測的最低極限濃度分別為1.6和8pg·μL-1，該方法檢測PEDV比TGEV靈敏度高。

M: DNA分子量標記DL2000； 1-10：陰性對照、PEDV+TGEV、TGEV、PEDV、PCV2、RAV、PRRSV、CSFV、PRV、PPV

M：DNA分子量標記DL2000；圖A、B、C中，1：陰性對照；2-7：PEDV和TGEV RNA濃度分別為1000、200、40、8、1.6 和0.32 pg·μL-1

2.5 臨床樣品應用檢測

采用環介導間接PCR、常規RT-PCR和SYBR Green 實時RT-PCR 3種檢測方法對157份疑似腹瀉癥狀的病料進行了比較檢測。結果顯示（表2），在157份臨床樣品中，，環介導間接PCR檢出PEDV陽性53份，TGEV陽性42份；常規RT-PCR檢出PEDV陽性34份，TGEV陽性21份；SYBRGreen 實時RT-PCR檢出PEDV陽性57份和TGEV陽性44份。3種方法的PEDV檢出率分別為33.76%、21.66%和36.31%，TGEV檢出率分別為26.75%、13.38%和28.03%。采用kappa檢驗分析環介導間接PCR和SYBR Green 實時RT-PCR對157份臨床樣本檢測結果的一致性，結果顯示（表3），與SYBR Green 實時RT-PCR相比，環介導PCR對PEDV檢測的敏感性、特異性分別為91.23%、98.22%，二者的符合度為96.18%（κ=0.91）；對TGEV檢測的靈敏度、特異性分別為90.91%、95.23%，二者的符合度為96.18%（κ=0.90）。結果表明,在臨床樣本檢測中，環介導間接PCR對PEDV和TGEV檢測敏感性與SYBR Green 實時RT-PCR相似，優于常規RT-PCR，而且環介導間接PCR與SYBR Green 實時RT-PCR檢測符合度高。

表2 常規PCR、環介導間接PCR和SYBR Green實時RT-PCR 對臨床樣本的PEDV、TGEV檢出率比較

表3 環介導間接PCR和SYBR Green 實時RT-PCR對臨床樣本檢測的敏感性、特異性分析

3 討論

目前，豬流行性腹瀉（PED）和傳染性胃腸炎（TGE）是規模化豬場對豬群危害最嚴重的2種病毒性腹瀉病，因發病時間短、傳播速度快、仔豬發病率和死亡率高等特點而廣受關注[28]。PEDV和TGEV同屬于α冠狀病毒屬，臨床上由于二者常常混合感染而引起仔豬腹瀉，且臨床癥狀、流行病學和病理學特征極為相似，給臨床診斷和疾病預防帶來一定困難。

以PCR為基礎的分子診斷技術因具有高效、快速、靈敏、準確等優點而廣受重視，是目前病原學鑒別診斷常用方法。鑒于冠狀病毒的高變異性，作者選擇PEDV和TGEV病毒相對比較保守的核蛋白（N）基因為檢測的目的基因，通過分析兩種病毒N基因序列特征，分別選取PEDV和TGEV N基因一段高度保守區為檢測探針，其中PEDV探針長度為44bp ，TGEV探針長度42bp ，且二者差異性較大。將檢測探針序列分為左右兩部分形成雙探針（L Probe 和R Probe），分別標記于擬南芥TOC1基因而獲得標記的報告基因。根據環介導間接PCR技術原理，當且僅當雙探針同時與目的基因雜交結合后，才能將報告基因左右兩端拉近而發生單鏈置換和環化反應，由于標記的報告基因長度不同（PEDV和TGEV報告基因的長度分別為404，252bp），形成的環化報告基因大小不同（PEDV 404bp，TGEV 252bp），通過反向PCR擴增環化報告基因而實現對PEDV/TGEV的鑒別診斷。試驗結果表明，通過優化報告基因的用量和試驗條件，獲得了最佳反應條件，成功擴增了404、252bp的報告基因（圖2），擴增條帶清晰、單一，經測序分析發現，上述擴增片段中分別含有一段長度44bp PEDV N基因序列和42bp TGEV N基因序列，且與NCBI數據庫中的PEDV和TGEV N基因的同源性達98.5%以上。試驗結果表明，該方法檢測特異性強，與CSFV、PRRSV、PRV、PPV和RAV等豬群中常見病原無明顯交叉擴增（圖3）；靈敏度高，對PEDV、TGEV可檢測的最低極限濃度分別為1.6 和8pg·μL-1（圖4）。研究中，應用環介導間接PCR、常規RT-PCR和SYBR Green 實時RT-PCR 3種方法對157份疑似腹瀉病料進行對比檢測，評估3種檢測方法的效果。結果發現（表2），3種方法對PEDV檢出率分別為33.76%、21.66%、36.31%，對TGEV檢出率分別為26.75%、13.38%、28.03%，在157份臨床樣本中，PEDV的陽性率明顯高于TGEV，而且PEDV和TGEV混合感染的比例較高，說明PEDV仍然是當前河南省內仔豬腹瀉的主要病原，同時存在較高比例的混合感染現象，與文獻報道[29-30]相一致，提示在仔豬病毒性腹瀉的防控中應結合疫病特點；而在陽性樣本檢出率上，環介導間接PCR明顯優于常規RT-PCR,而接近SYBR Green 實時RT-PCR，因常規RT-PCR檢測敏感性依賴于RNA的完整性和反轉錄效率，而環介導PCR檢測方法則通過雙探針與目的基因雜交環化，鏈置換為報告基因，不需要反轉錄，探針雜交也僅需要40—50bp 的核酸序列，對RNA完整性要求不高，能有效克服因樣品不新鮮導致核酸降解、中間斷裂而引起漏檢現象。kappa檢驗結果顯示（表3），與SYBR Green 實時RT-PCR相比，環介導間接PCR檢測技術對PEDV檢測的敏感性、特異性分別為91.23%、98.22%,兩種方法檢測結果的符合度為96.18%（κ=0.91, 表3）；對TGEV檢測的靈敏度、特異性分別為90.91%、95.23%，兩種方法檢測結果的符合度為96.18%（κ=0.90，表3），kappa檢驗結果表明本研究所建立的環介導間接PCR與經典的SYBR Green實時RT-PCR與檢測結果高度吻合（κ≥ 0.90），可以替代經典的SYBR Green實時RT-PCR用于臨床上鑒別診斷PEDV和 TGEV引起的豬病毒腹瀉。

4 結論

綜合方法的特異性、敏感性及臨床檢測結果，表明本研究所建立的環介導間接PCR檢測方法不僅適用于臨床上鑒別診斷PEDV和 TGEV引起的豬病毒性腹瀉，而且可以用于豬病毒性腹瀉的分子流行病學調查。

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（責任編輯 林鑒非）

Establishment and Application of Loop-mediated Indirect PCR Assay Based on Single-strand Substitution for Detection and Differentiation of PEDV and TGEV

ZHENG Ming, LI HuaWei, LIU YingYing, WANG YongFen, BIAN ChuanZhou, GUO HongWei

(Henan University of Animal Husbandry and Economy, Zhengzhou 450046)

The virus diarrhea of pigs is an acute and highly contagious enteric disease, which is mainly caused by the porcine epidemic diarrhea virus (PEDV) and the porcine transmissible gastroenteritis virus (TGEV). The clinical signs of the disease mainly include vomiting, diarrhea, dehydration, high morbidity, and mortality. PEDV and TGEV belong to two distinct species of thegenus within. Pigs of all ages are susceptible, especially the piglets, which can lead to death of large numbers of piglets and cause huge economic losses to the swine industry. Due to the clinical symptoms, pathologic changes and epidemiology are very similar, it is difficult to distinguish them by clinical diagnosis. Therefore, the rapid, specific preclinical identification of PEDV/TGEV is of great significance for preventing the outbreak and spread of this disease. The aim of this study is to establish the method of loop-mediated indirect PCR assay for the detection of PEDV/TGEV and the etiologic diagnosis for viral diarrheas in piglets.According to the genome sequence information of PEDV and TGEV in GenBank database, a highly conserved region of PEDV and TGEV nucleoprotein (N) gene sequences were selected based on the homology comparison of the two viral genes. Two pairs of specific adjacent probes were designed, which were labeled on both ends ofgene fragments of different sizes as specific probe-labeled reporter genes for loop-mediated indirect PCR. After hybridizing with the target genes and cyclizing, the probe-labeled reporter genes were amplified by reverse PCR. The loop-mediated indirect PCR assay had been developed for the detection of PEDV/TGEV, and the specific PCR products were 404bp for PEDV and 252bp for TGEV, respectively.The experimental results showed that the assay could be useful for the specific detection of PEDV and TGEV, from a contaminated sample by any one of them or by both. The specificity and sensitivity of the loop-mediated indirect PCR assay were tested. The results showed that the specificity was high, and no cross-amplification was observed with other common swine-borne viruses such as PCV2, RAV, PRRSV, CSFV, PRV and PPV. The lowest detection limits of the loop-mediated indirect PCR assay were 1.6 pg /μL for PEDV and 8 pg /μL for TGEV, respectively. And simultaneous detection of both pathogens did not affect the detection sensitivity. The comparison test was conducted on 157 clinical samples collected from adjacent pig farms by loop-mediated indirect PCR, conventional PCR and SYBR Green real-time RT-PCR. The results showed that the PEDV positive detection rates of loop-mediated indirect PCR, conventional PCR and SYBR Green real-time RT-PCR were 33.76%, 21.66% and 36.31% respectively, and the TGEV detection the positive rates were 26.75%、13.38% and 28.03% respectively. Results of Kappa analysis showed that, for both PEDV and TGEV detection, overall agreements between the loop-mediated indirect PCR and the SYBR Green real-time RT-PCR were both 96.18% with a kappa value of greater than or equal to 0.90.The study suggested that the established loop-mediated indirect PCR was a rapid, accurate, sensitive and specific etiologic diagnosis tool, suitable for the differential diagnosis of PEDV and TGEV.

porcine epidemic diarrhea virus; transmissible gastroenteritis virus; loop-mediated indirect PCR; probe; reporter gene

2017-06-01；

2017-11-15

河南省科技開放合作項目（152106000010）、河南省教育廳科技攻關項目（13A230382）

鄭鳴，Tel：13526470021；E-mail：floatingzm@163.com。

郭宏偉，E-mail：ghw221@126.com