新生SD大鼠心肌細胞的原代培養①

趙 勇，劉曉偉，林治宇，馬 雷，徐振宇，呂少春，李梅秀，田國忠

(佳木斯大學，黑龍江 佳木斯 154007)

新生SD大鼠心肌細胞的原代培養①

趙 勇，劉曉偉，林治宇，馬 雷，徐振宇，呂少春，李梅秀，田國忠

(佳木斯大學，黑龍江 佳木斯 154007)

目的:探討乳鼠原代心肌細胞的培養方法，簡便穩定地獲得高存活率和純度的心肌細胞。方法: 無菌條件下取1～3d內新生SD大鼠的心室肌組織，首先用胰蛋白酶消化心肌組織一次，再用I型膠原酶短時多次消化，然后應用差速貼壁分離法和化學試劑抑制法純化心肌細胞。對心肌細胞進行形態學觀察、存活率檢測和免疫熒光鑒定。結果:臺盼藍染色檢測心肌細胞存活率在95%以上。培養24h后的心肌細胞已貼壁生長，呈梭形及多邊形，有自發性搏動，48h后細胞偽足相互交織成網，進而形成細胞簇，呈現同步性搏動。免疫熒光鑒定心肌細胞純度達96%。結論:此種方法能夠可靠地獲得較高存活率和純度的原代乳鼠心肌細胞。

心肌細胞；原代培養；新生大鼠

體外培養的原代心肌細胞，其細胞成分單一，且相對集中，具備原有的許多結構和功能，還消除了神經、體液等因素的影響，因此在研究心肌細胞生理、病理、心血管疾病的發病機制及藥物作用機理等方面都有廣泛的應用。關于心肌細胞原代培養的文獻報道很多，但如何獲得較高存活率和純度的心肌細胞仍是關鍵問題。本研究對乳鼠心肌細胞分離與培養的方法進行了深入探討，經過一系列實驗觀察，總結出一種穩定可靠的原代心肌細胞培養方法，能培養出純度高、活力強的心肌細胞。

1 材料和方法

1.1 實驗動物

1～3d的新生SD大鼠10～16只，雌雄不限，由哈爾濱醫科大學實驗動物中心提供。

1.2 主要試劑

胰酶(Beyotime)，I型膠原酶(Sigma)，DMEM(HyClong)，胎牛血清(四季青)，5-溴脫氧尿嘧啶核苷(5-Bromo-2-deoxy Uridine，BrdU)(Sigma)，α-橫紋肌肌動蛋白(α-Sarcomeric actinin)單克隆抗體(博士德)，FITC(北京中杉金橋)，DAPI(博士德)。

1.3 新生大鼠心肌細胞的制備

取出生1～3d的SD大鼠，雌雄不限，用75%酒精對乳鼠全身皮膚進行消毒3次，在劍突上一肋剪開胸骨，擠出心臟，將心尖周圍組織剪下放入預冷的D-Hanks液中反復沖洗3次，將心肌剪成0.5～1mm3大小的糜狀物后放入一小玻璃瓶中，加入0.08%胰酶溶液，放入磁力攪拌子，蓋好瓶口，放在磁力攪拌器上，37℃水浴下，以60～80r/min轉速攪拌消化4min。棄去上清液，再加入0.1%的I型膠原酶溶液反復消化6～9次或者至組織塊完全消化(肉眼見組織由紅轉白呈半透明)為止，每次消化8min，將上清液移入尖頭無菌離心管中，加入含10%胎牛血清(FBS)的DMEM培養液以終止消化。然后將上清液經200目篩網過濾(去除未消化組織及細胞團)，以1000r/min離心10min，棄去上清液，在沉淀中加入含10%FBS的DMEM培養液，反復輕輕吹打后將細胞懸液移入直徑10cm的無菌培養皿中，放入含5%CO2的37℃培養箱中孵育90min，按差速貼壁分離法除去成纖維細胞純化心肌細胞。取出該培養皿，將未貼壁細胞懸液以2×105/mL密度接種于6孔板中(孔底預先放置無菌6孔板專用細胞爬片)，加入終濃度為0.1mmol/L的BrdU以抑制成纖維細胞生長，放在37℃、5% CO2飽和濕度培養箱中培養。48～60h首次換液且不加BrdU，以后隔1天換液。

1.4 心肌細胞存活率檢測

將適量細胞懸液與0.4%臺盼藍溶液9:1混勻，靜置1min，然后將混合液滴于細胞計數板上，計數500個細胞，活細胞不被染色，而死細胞則被染成藍色。細胞存活率=活細胞數/細胞總數×100%。

1.5 心肌細胞的形態學觀察

用倒置顯微鏡觀察細胞的形態變化和搏動情況。

1.6 心肌細胞的免疫熒光鑒定

心肌細胞培養48～60h后取出細胞爬片，PBS漂洗3次，4%多聚甲醛固定20 min，PBS漂洗3次，0.1%Triton X-100透化20min，PBS漂洗3次，10%山羊血清室溫封閉30min，加入小鼠抗大鼠α- Sarcomeric actinin(橫紋肌肌動蛋白)抗體，4℃過夜，PBS漂洗3次，加入偶聯FITC的熒光二抗，避光室溫孵育1h，再加入DAPI 避光孵育5 min，倒置熒光顯微鏡下拍照。隨機取10個高倍視野，心肌細胞胞漿被抗α- Sarcomeric actinin抗體特異性染成綠色，DAPI 將細胞核染為藍色，計數綠色胞質細胞數及藍色細胞核數。心肌細胞純度(%)=綠色胞質細胞數/藍色細胞核數×100%。

1.7 統計學方法

2 結果

2.1 原代培養的心肌細胞存活率檢測

光鏡下觀察計數板上的心肌細胞懸液與臺盼藍溶液的混合液中心肌細胞的顏色，藍色為死細胞，未染色的為活細胞。經檢驗，本實驗原代培養的乳鼠心肌細胞存活率在(96.68±0.67)%，見表1。

表1 大鼠心肌細胞存活率

2.2 心肌細胞形態學觀察

倒置顯微鏡下觀察可見，培養24h后的心肌細胞貼壁生長，伸出偽足呈梭形及多邊形，折光度較強，有自發性搏動，但節律和強度不同；48h后細胞偽足相互交織成網，進而形成細胞簇，呈現同步性搏動，頻率為40～90次/分鐘。

2.3 心肌細胞的免疫熒光鑒定

采用細胞免疫熒光技術在激光共聚焦顯微鏡下觀察見圖1，2，所得心肌細胞純度達(96.7±3.5)%，見表2。

圖1 心肌細胞鑒定IF×(100)

圖2 心肌細胞鑒定IF×(600)

實驗次數心肌細胞純度(%)197．2296．8396．9496．5596．3

3 討論

首先無菌操作非常重要，乳鼠的全身酒精消毒3次，剪開皮膚、取心肌組織的剪刀和剪碎心肌要使用3把不同的剪刀，這三個步驟所涉及的鑷子也要區分開，另外在劍突上一肋橫行剪開胸骨要避免破壞消化道導致污染。只要進行嚴格無菌操作，即使不加抗生素細胞培養不會被細菌污染，這樣既不會影響細胞的生長，也排除了藥物干擾因素。消化心肌組織常用的酶有胰蛋白酶和膠原酶[1]，胰蛋白酶能水解細胞間的蛋白質，但作用較強，容易損傷細胞膜，單獨使用胰蛋白酶，很難穩定得到大量活力較強的心肌細胞。膠原酶作用較溫和，通過分解細胞間質中的膠原纖維來釋放細胞，在新生大鼠心肌組織中，以I型膠原為主[2]，因此我們選用I型膠原酶來分離心肌細胞，經過多次實驗得出使用1% I型膠原酶，短程多次消化，便能獲得大量活力較強的心肌細胞。以往常用胰蛋白酶和膠原酶[3～6]的混合液來消化心肌組織，我們也嘗試過多次，即使調低酶的濃度，縮短每次消化時間，仍常有消化過度的情況。另外，消化時我們使用磁力攪拌子來攪拌酶液中的心肌組織，使二者充分接觸，提高消化效率。消化后的心肌組織中含有大量的成纖維細胞，所以去除成纖維細胞是純化心肌細胞的關鍵。根據成纖維細胞貼壁速度快于心肌細胞的特點，本實驗采用差速貼壁分離法除去絕大部分成纖維細胞，并結合化學試劑抑制法在培養的48～60h內應用Brdu抑制成纖維細胞的生長，這樣能夠獲得純度較高的心肌細胞。

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[6]趙華.銀杏葉提取物對H2O2致乳鼠心肌細胞損傷的保護作用[J] . 黑龍江醫藥科學，2009,32(2)：8-9

1.國家自然科學基金項目，編號：81370342；2.黑龍江省大學生創新創業訓練計劃項目，編號：201610222073；3.佳木斯大學科研項目編號：13Z1201531，13Z1201535；4.黑龍江省教育廳科研項目，編號：2016-KYYWF-0608；5.黑龍江省研究生創新項目，編號：YJSCX2012-368HLJ。

趙勇(1977～)男，黑龍江佳木斯人，碩士，副教授。

田國忠(1966～)男，黑龍江北安人，博士，教授，博士研究生導師。E-mail：tgz1966@163.com。

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1008-0104(2017)06-0001-02

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