高脂血癥大鼠陰莖海綿體細胞中VEGF及H2S含量的變化對勃起功能的影響①

郭玉剛，馬 超，陳大印，馬運躍

(佳木斯大學附屬第一醫院泌尿外科，黑龍江 佳木斯 154003)

高脂血癥大鼠陰莖海綿體細胞中VEGF及H2S含量的變化對勃起功能的影響①

郭玉剛，馬 超，陳大印，馬運躍

(佳木斯大學附屬第一醫院泌尿外科，黑龍江 佳木斯 154003)

目的：通過對高脂血癥大鼠陰莖海綿體中血管內皮生長因子(VEGF)以及硫化氫(H2S)含量變化的研究探討其對勃起功能的作用。方法:雄性Wistar大鼠32只隨機分為高脂血癥組16只和正常對照組16只。高脂血癥模型通過對高脂血癥組大鼠喂養高脂飲食完成。于模型建立成功第10天和20天分別取各組大鼠中一半進行阿撲嗎啡實驗并觀察其勃起功能。解剖出大鼠陰莖組織制備勻漿后分別通過用雙抗體夾心ELISA法(Double antibody sandwich ELISA)和分光光度計對大鼠陰莖海綿體內的VEGF和H2S進行量化測定。結果:模型組大鼠陰莖海綿體內第10天的VEGF含量、H2S合酶活性、陰莖勃起次數與正常對照組均有顯著性差異(P<0.05)；模型組陰莖海綿體內第20天VEGF含量、H2S合酶活性、陰莖勃起次數與正常對照組均有顯著性差異(P<0.05)；高脂血癥組之間陰莖海綿體內第20天與第10天VEGF含量、H2S合酶活性及陰莖勃起次數差異均有顯著性(P<0.05)。結論：高脂血癥致使大鼠陰莖組織中VEGF的含量和H2S合酶的活性的降低，VEGF、H2S合酶的活性的降低可能是高脂血癥導致勃起功能障礙(ED)另一發病機制。

高脂血癥；VEGF；H2S合酶；勃起功能障礙；陰莖海綿體

高脂血癥(hyperlipidemia)是心腦血管疾病的重要的危險因素之一，中老年人血脂升高極易引發心血管疾病和全身動脈粥樣硬化。高脂血癥導致勃起功能障礙的發生可以在國內外現有諸多文獻找到，且國外文獻曾指出勃起功能的改變可能是全身動脈粥樣硬化的早期眾多的臨床表現中的改變之一[1]，同時國內外眾多關于高脂血癥引起勃起功能改變的文獻指出陰莖動脈狹窄、閉塞的改變多發生于晚期，而陰莖平滑肌細胞、內皮細胞以及陰莖的外周神經的損傷多發生在早期。內源性H2S是繼一氧化碳(CO)和一氧化氮(NO)之后發現的另一種具有舒張血管、降壓等作用的氣體信號分子，廣泛的被稱叫做第三種氣體信號分子。VEGF是一種高度生物活性的具有促進內皮細胞分裂、增殖、轉移等作用參與體內諸多生理和病理過程的多功能細胞因子,但是就目前的已進行的關于VEGF的研究來看，在ED方面的研究甚少,因此本實驗的研究著重問題旨在研究高脂血癥大鼠陰莖組織中VEGF含量的變化以及H2S合酶活性的變化是否是導致陰莖勃起功能障礙眾多機制中的另一機制。

1 材料與方法

1.1 材料

動物:實驗所用的大鼠均是由哈爾濱醫科大學動物實驗中心提供的健康的同一批孕育生產的平均體重約300g左右的雄性Wistar大鼠。實驗所用的藥品以及試劑盒: 血清總膽固醇TC試劑盒、甘油三酯TG試劑盒、低密度脂蛋白LDL-C試劑盒、食用豬油、膽固醇、食用蛋黃、甲基硫氧嘧啶、膽鹽、阿撲嗎啡、5′2′ 磷酸吡哆醛、醋酸鋅、三氯醋酸、L2半胱氨酸、對苯二胺鹽酸鹽、三氯化鐵、VEGF試劑盒、考馬斯亮蘭法蛋白試劑。

1.2 方法

1.2.1 動物分組

將大鼠隨機分為高脂血癥組(A組)16只，正常對照組(B組)16只。適應性喂養1周后，兩組動物分籠飼養，并保持環境室溫、濕度、光照、溫度的一致性。

1.2.2 動物模型的制備

①A組喂養高脂飼料，定時飲水，適當輔喂水果。高脂飼料的配方為自行配制。高脂飼料的飲食配方具體如下：復合飼料90%、1%膽固醇、2%食用蛋黃、7%豬油、0.3%甲基硫氧嘧啶、0.7%膽鹽。兩組大鼠經過不同的飲食喂養8周后，分別用相應的試劑盒測定TC、TG、LDL-C的含量。當測得的三項指標均大于正常對照組的2倍時證明建模成功。②.B組動物每天給予正常的復合飼料喂養，定時飲水，適當輔喂水果。

1.2.3 指標檢測和方法

①血液檢查:在模型建立成功后繼續喂養，并分別在實驗10d,20d時早上空腹逐段切斷大鼠尾部收集血樣,并用相應的試劑盒無菌環境中嚴格按照試劑盒的使用說明和步驟進行測定TC、TG、LDL-C的含量。②陰莖勃起功能檢測：于建模成功后第10d、20d，保持實驗室的安靜，確保大鼠處于放松的狀態，以阿撲嗎啡(APO)5mL/kg于大鼠頸部皮下注射，注射后對大鼠觀察約半小時，記錄期間陰莖勃起次數和各組勃起率。大鼠的陰莖勃起的評定方法為：海綿體的充血及龜頭即陰莖體末端明顯露出為準。③VEGF的測定:本實驗依照VEGF試劑盒的具體說明依次對各組大鼠陰莖海綿體周圍血清 VEGF 含量進行檢測。④ 陰莖組織中H2S合酶活性的測定：實驗最后用斷脊髓法處死大鼠并解剖出陰莖組織，把陰莖組織放于50mmol/ L、pH 6.8的冷凍磷酸鉀緩沖液的制備勻漿,然后在 50mL的錐形燒瓶進行反應 ,反應底物的總體積為2mL，其中含100mmol/L、pH 7.4磷酸鉀緩沖液、10mmol/L的 L2半胱氨酸、2mmol/L的5′2′磷酸吡哆醛和10%組織勻漿。然后把2mL濃度為1%醋酸鋅加入其中。燒瓶中充入氮氣，30s 之后再加入0.5mL 50%三氯醋酸中止反應,水浴1min后將其中的內容物轉移到含4mL蒸餾水的試管中,加入0.5mL的20mmol/L 對苯二銨鹽酸鹽和0.4mL的30mmol/L 三氯化鐵。室溫孵育半小時,用752型分光光度計在波長670nm處檢測溶液吸光度。根據 H2S濃度標準曲線計算溶液H2S含量 ,組織中H2S合酶活性以單位重量的組織在單位時間內生成 H2S的量(nmol/mg.tissue.min)表示，采用分光光度法測定H2S濃度。

1.3 統計學方法

2 結果

2.1 兩組血脂情況

先后于建模成功后的第10天、第20天，對兩組大鼠通過TC、TG 、LDL-C試劑盒測得的血脂情況見表1。

表1 實驗組和空白對照組組的血脂情況

注：與對照組比較P<0.05；②與高脂血癥組10d比較P<0.05。

由以上數據可以看出，A與B組相較，大鼠血中TC、TG、LDC-C的含量明顯增高，且隨時間的進一步延長A組第20天較A組第10天TC、TG、LDC-C的含量亦有明顯的增高(P<0.05)，具有顯著差異性。

2.2 阿撲嗎啡實驗

模型建立成功后，分別在第10天和第20天，對兩組大鼠進行阿撲嗎啡實驗。實驗的第一步是調配阿撲嗎啡溶液(鹽酸阿撲嗎啡4mg溶解于生理鹽水中)。然后以5mL/kg給大鼠頸部皮下注射，在安靜的環境中，保持大鼠不受巨大驚嚇，記下30min內的勃起次數，最后計算每一組大鼠的陰莖勃起率。見表2。

表2 高脂血癥組與空白對照組大鼠陰莖勃起次數勃起率的情況

注：與對照組比較P<0.05；②與高脂組10d比較P<0.05。

由以上數據可以看出，A與B組相比較，A組的大鼠的勃起次數和勃起率較B組明顯減低(P<0.05)，并且隨著時間的進一步延長A組第20d較第10d勃起次數和勃起率亦有明顯的降低(P<0.05)，差異具有顯著性。

2.3 A組和B組大鼠陰莖組織中VEGF含量、H2S活性

解剖出大鼠陰莖組織制備勻漿后分別通過用雙抗體夾心ELISA法(Double antibody sandwich ELISA)和分光光度計對大鼠陰莖海綿體內的VEGF和H2S進行量化測定。見表3。

表活性

注：與對照組比較P<0.05；②與高脂血癥組10d比較P<0.05。

由以上數據可以看出，A與B組相比較，A組的VEGF量明顯降低，并且隨著時間的進一步延長A組第20天較A組第10天高脂組大鼠陰莖海綿體組織中VEGF量明顯降低；A組H2S活性較對照組明顯降低，并且第20天大鼠陰莖海綿體組織中H2S活性較10d降低(P<0.05)，具有統計學意義。并且還可以 從表中的數據看出二者的改變趨勢呈現相同的改變。

2.4 大鼠陰莖組織中VEGF量與H2S含量的相關性分析

見表4。

表4 大鼠陰莖組織中VEGF的量與H2S含量的相關性分析

通過統計學相關性分析的數據得知大鼠陰莖組織中VEGF的平均值與H2S含量呈顯著性正相關。

3 討論

ED隨日常工作和生活節湊的加快，生活壓力的增加，有逐年增高的趨勢，嚴重影響中老年男性患者的生活質量和夫妻關系的和諧度，所以其流行病學和發病機制的研究成為世界上很多學者研究的著重研究方向。陰莖動脈血流的增加、海綿體竇舒張、陰莖靜脈血回流減少三者間能夠協調[2]配合的神經體液機制是陰莖正常勃起不可或缺的必備條件，這是通過既往的大量實驗研究所得出的結論。NO/cGMP是正常發動陰莖勃起功的經典通路。H2S通過調節平滑肌的張力而對血管的生理性產生調節作用,而它的舒張血管的作用是通過促使內皮源性超極化因子及NO從內皮細胞中釋放來實現的。半胱氨酸經過胱硫醚-β-合成酶(CBS) 和胱硫醚-γ-裂解酶(CSE) 催化而生成下內源性H2S[3]。研究發現人類陰莖海綿體組織內也表達CBS和CSE[4]，國外也有向靈長類動物的海綿體內注射硫氰化鈉(NaHS，內源性H2S在體內的一種存在形式)，可使陰莖長度和海綿體壓力有明顯的增加[5]的實驗，所以H2S與勃起功能的關系是不言而喻的，因此高脂血癥導致陰莖勃起功能障礙與H2S合酶活性下降應該存在關聯。此外H2S 的舒張調節功能不完全依賴cAMP的調節機制，還存在其它生理機制[6]。如K+-ATP 通道，既往的研究發現H2S在機體其它組織內還可以通過Cl-/HCO3-通道發揮舒張調節功能，但該通路尚未在陰莖海綿體平滑肌組織中有相關研究[7]。H2S與NO在陰莖勃起過程中可以相互影響。 H2S可以通過直接影響內皮源性NO合酶(eNOS) 在組織內的表達，也可以通過開放 K+-ATP 通道或結合四氫生物喋呤 (NOS的輔助因子)影響eNOS的活性，從而影響NO的產生。H2S也可能通過減少組織對 L-精氨酸(eNOS產生NO的底物) 在組織器官的攝取而影響NO的合成[8]。NO可以通過對活性底物L-半胱氨酸的調節[9]，因此H2S對大鼠勃起功能的影響的機制是比較復雜的，可能以其中的一種機制為主導，也可以是幾條機制并存并相互影響的結果。

VEGF具有高度的生物活性，在機體內參與了體內諸多生理和病理過程發揮眾多作用，可以促進血管內皮細胞的分裂、增殖、轉移[10]等多種功能，它最早是作為一種特異性促進血管內皮細胞增值、生長的因子由 Ferrara 等[11]從牛的垂體星形濾泡細胞分離提取出的。上世紀九十年代末Burehardt等曾發現許多不同的VEGF-mRNA的剪接變體可以在大鼠和人陰莖中表達,其中以VEGF164(大鼠的)或VEGF165(人的)編碼的蛋白的量居多。國內外都有相關實驗證明轉染VEGF基因對動脈性ED大鼠治療有效。由此看出,VEGF與陰莖勃起關系密切。

本研究通過對高脂血癥大鼠陰莖海綿體中VEGF、 H2S的含量變化的測量,證明了它們與ED之間關聯性,即當高脂血癥發生時，VEGF的量與H2S的量都發生了相應不同程度的降低，通過相關性分析，可以證實二者存在關聯并呈正相關性改變,這豐富了高脂血癥引起勃起功能障礙的發病機制,同時也為ED的治療提供了一定的理論依據。但是該研究未證實VEGF是直接影響H2S含量的變化還是通過影響NO的產生繼而在影響H2S量的改變，以及是否二者之間存在明確的作用通路導致高脂血癥時勃起功能障礙的發生，總之該研究領域還很局限,大量的問題亟待探究,需要我們進行大量的實驗來證實。

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黑龍江省衛生廳科研課題，編號：2012-220。

郭玉剛(1967～)男，黑龍江佳木斯人，碩士，主任醫師，教授，碩士研究生導師。

R589.2

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1008-0104(2017)06-0047-03

2017-06-12)