法舒地爾對缺氧缺血性腦損傷新生大鼠血腦屏障通透性的影響①

張雅麗，王顯鶴，鮑 勃，朱章龍

(佳木斯大學附屬第一醫院兒內一科，黑龍江 佳木斯 154003)

法舒地爾對缺氧缺血性腦損傷新生大鼠血腦屏障通透性的影響①

張雅麗，王顯鶴，鮑 勃，朱章龍

(佳木斯大學附屬第一醫院兒內一科，黑龍江 佳木斯 154003)

目的：研究法舒地爾對缺氧缺血性腦損傷(Hypoxic ischemic brain damage，HIBD)新生大鼠血腦屏障(blood brain barrier，BBB)通透性的影響，并探討其對腦損傷潛在的保護機制。方法：隨機選取7d齡Wistar新生大鼠144只，分為3組：假手術組，缺氧缺血組(Hypoxic ischemic ，HI組)和法舒地爾組。建立HIBD動物模型，所有動物于造模后6h、24h、72h處死。伊文思藍(evans blue ，EB)滲漏實驗評估BBB的通透性，大腦皮層Claudin-5的表達采用免疫組織化學法。結果:HI組新生大鼠腦組織中Claudin-5表達在HI后6h下降明顯(P<0.05)，同時伴有明顯的BBB通透性明顯增高(P<0.05)。法舒地爾組各時間點Claudin-5表達均高于HI組(P<0.05)，且其BBB 通透性較HI組明顯減低(P<0.05)。結論:法術地爾對HIBD新生大鼠的BBB有保護作用，其可能機制是通過促進緊密連接蛋白Claudin-5的表達，減少緊密連接的破壞，發揮BBB的保護作用。

缺氧缺血性腦損傷；Claudin-5；血腦屏障 ；法舒地爾

新生兒缺氧缺血性腦病(hypoxic ischemic encephalopathy，HIE)是危及新生兒生命的重要原因。其中10%～20%死于新生兒期[1]，存活者中25%～30%遺留不同程度的后遺癥[2]，如腦癱，精神發育遲緩，癲癇等。這給家庭和社會造成了巨大的負擔，同時增加了兒科醫生的壓力。因此，急需對HIE的發病機制及有效治療方法進行進一步研究。

腦水腫是HIE最基本的病理改變，而且是其病情發展，甚至惡化、死亡的主要原因。因此，及早控制腦水腫對HIE的愈后至關重要。目前為止，已有許多機制用來闡明腦水腫的發生及發展。Claudin-5是BBB旁通路中緊密連接的重要蛋白之一，大量研究發現其在腦缺血后的腦水腫中發揮重要作用，然而，其在新生大鼠HIBD及其腦水腫的研究中鮮有報道。法舒地爾通過抑制Rho/ROCK信號通路，可抑制腦缺氧缺血后的一系列病理生理變化，是作為目前唯一應用于臨床的ROCK抑制劑，有研究發現其對保持血腦屏障完整性也具有重要作用。

1 材料和方法

1.1 主要試劑

法舒地爾(天津紅日)，伊文思藍(EB，Sigma公司)，甲酰胺(Sigma公司)，Claudin-5抗體(武漢博士德生物工程公司)，DAB顯色試劑盒(武漢博士德生物工程公司)。

1.2 動物分組與給藥方法

7d齡Wistar大鼠144只，雌雄不限，體重11～19g，由哈醫大動物實驗中心提供，隨機分成3組：假手術組，缺氧缺血組，法舒地爾組。假手術組僅行右側頸總動脈游離，HI組參照動物模型制造。法舒地爾組在缺氧后即刻腹腔注射法舒地爾10mg/kg。每組再隨機分為2個亞組：分別用于BBB通透性及免疫組織化學染色。該研究嚴格按照國際衛生院關于實驗動物的護理及使用指南。

1.3 動物模型的制備

參照經典Rice模型，結合國內母得志等人的方法建立HIBD模型，7d齡新生大鼠，乙醚吸入麻醉后，仰臥位固定于操作臺上，依次切開皮膚及皮下組織，游離右側頸總動脈，7-0手術絲線結扎后還納，縫合皮下組織及皮膚。整個手術過程在10min內完成。放回母鼠身邊恢復30min后，將其放入8% O2、92% N2混合氣體的低氧艙處理2.5h，流量為2 L/min，經低氧處理后的新生大鼠放回母鼠籠中飼養。假手術組僅行右側頸總動脈游離，不行結扎及缺氧處理。

1.4 伊文思藍BBB通透性的測定

通過檢測腦組織伊文思藍含量測定腦組織通透性，每亞組隨機抽取8只新生大鼠，在取腦前30min經尾靜脈注射2% EB生理鹽水溶液(2mL/kg),可見小鼠鞏膜及皮膚迅速變成藍色。麻醉后快速開胸，暴露心臟，剪開右心耳，用生理鹽水左心室進行心臟灌流，直至流出液體為清亮，立即斷頭取腦，分離雙側大腦皮層，分別稱重兩側腦組織，加入2倍體積的甲酰胺，60℃水浴中孵育24h，離心取上清液，用全自動酶標儀，620mm測定上清液吸光度(optical density，OD)值，腦組織EB含量計算公式：腦組織EB含量(μg/g)=待測樣品EB含量(μg/mL)×甲酰胺溶液(mL)/腦濕重(g)，待測樣品EB含量是根據標準曲線回歸方程求得。

1.5 大鼠大腦皮質Claudin-5蛋白的表達

每亞組隨機抽取8只新生大鼠，乙醚麻醉后，快速打開胸腔，用20mL注射器于左心室灌注生理鹽水，同時剪開右心耳，至流出液體變清為止。再灌注4% 多聚甲醛，至肝臟明顯變白后斷頭取全腦，并立即保存于4% 多聚甲醛溶液中固定72h以上。將固定的鼠腦從視交叉后2～6mm以5μm厚度進行連續冠狀切片。免疫組織化學SABC法觀察大腦皮質Claudin-5的表達。切片染色后每個樣本選取3張切片，每張切片于400倍光鏡下系統隨機選取2個

視野進行檢測，應用image-pro-plus6.0軟件分析系統測量。

1.6 統計學方法

2 結果

2.1 法舒地爾對HIBD新生大鼠BBB通透性的影響

與假手術組相比，HI后6hBBB通透性明顯升高(P<0.05)，隨后開始下降，但72h時其通透性仍高于假手術組；法舒地爾組各時間點BBB通透性較HI組降低(P<0.05)。見表1。

表1 各組新生大鼠腦組織伊文思藍的含量；n=8)

注：假手術組相比，▲P<0.0.5；與HI組比，#P<0.05；與組內6h比較*P<0.05。

2.2 法舒地爾對HIBD新生大鼠大腦皮質Claudin-5表達的影響

免疫組化法顯示，Claudin-5陽性染色為棕黃色顆粒，廣泛分布于血管內皮細胞包漿中。假手術組Claudin-5表達水平較高，深染，陽性密集分布。HI后6h組表達最低，染色淺(P<0.05)。與HI組比較，法舒地爾組各時間點大腦皮質Claudin-5表達均有升高(P<0.05)。見表2。

表2 各組新生大鼠大腦皮質Claudin-5蛋白的表達

注：與假手術組相比，▲P<0.0.5；與HI組比，#P<0.05；與組內6h相比，*P<0.05。

3 討論

圍生期窒息引起的部分或完全缺氧、腦血流減少或暫停而導致的胎兒或新生兒腦損傷是HIE的主要原因。其中，腦水腫是早期最主要病理改變，首先由于能量供應不足表現為細胞毒性腦水腫，隨著BBB的破壞，血管源性腦水腫占主要地位。近年來，越來越多的研究證實，BBB的破壞是腦水腫發生的直接原因。而緊密連接是BBB的重要組成成分，Claudin-5 作為腦微血管內皮細胞緊密連接中的特異性蛋白[3]，研究發現，Claudin-5的外源性表達可誘導 BBB 的形成[4]，亦有研究發現 Claudin-5基因剔除小鼠BBB嚴重受損[5]。馬騰等[6]通過建立體外血腦屏障氧糖剝奪模型，證實BBB通透性的增高與Claudin-5的降低相關。本研究結果顯示：假手術組新生大鼠 Claudin-5 沿腦微血管內皮細胞持續表達，呈連續性分布，且隨著時間的延長并無明顯下降；在HI后6h，新生大鼠Claudin-5 在微血管內皮細胞上的連續性分布及表達量顯著降低，且較同組其他時間相比，Claudin-5表達最低，同時間點BBB 通透性增加最顯著。這與王靜娥等[7]關于大鼠大腦中動脈缺血模型研究結果顯示缺血后6hBBB通透性最大相一致。提示，在新生大鼠HIBD中， BBB 通透性改變與 Claudin-5 表達下調、緊密連接開放可能存在密切關聯，且存在BBB通透高峰期。

Rho被認為與神經發育密切相關，其在神經細胞發育和突起形成中具有不可忽視的作用。Rho激酶作為目前研究最清楚的其下游靶分子，具有兩種異構體：ROCKⅠ和ROCKⅡ。其中，ROCKⅠ主要存在于肺、心、骨骼肌等組織細胞中，ROCKⅡ則主要存在與中樞神經系統中。ROCK能夠引起免疫細胞激活、BBB破壞、炎癥細胞遷徙等一系列病理改變。抑制其活化被認為是治療神經系統相關疾病的一個潛在靶點。有研究發現，HIBD新生大鼠腦組織Nogo表達明顯增高，阻斷Rho/Rho激酶信號通路可提高損傷后CNS的軸突再生和功能恢復[8，9]。Yamashita K[10]等研究發現，Rho激酶抑制劑法術地爾可能直接作用于神經細胞發揮保護作用。雖然有大量研究表明，法術地爾具有神經保護作用，但其具體作用機制并不明確。本研究發現，法術地爾組新生大鼠各時間點，大腦皮層Claudin-5在腦組織微血管上分布的連續性和表達明顯高于HI組(P<0.05)，同時其BBB通透性明顯下降(P<0.05)。其可能是通過使 Claudin-5的表達升高，封閉緊密連接，維持 BBB 的完整性，減輕腦水腫發生，進而保護腦組織。

綜上所述，法舒地爾對維持血腦屏障通透性具有重要作用。猜測其可能通過促進緊密連接Claudin-5 的表達，關閉血腦屏障旁通路，進而減輕炎癥反應，減少細胞水腫的發生,對HIBD起到保護作用。但本研究并未對炎癥因子進行研究，后續實驗將進行進一步研究。

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佳木斯大學研究生科技創新項目，編號: YM2016_059。

張雅麗(1988～)女，山西晉城人，在讀碩士研究生。

王顯鶴(1966～)女，黑龍江佳木斯人，碩士，主任醫師，碩士研究生導師。E-mail：xh99wang@163.com。

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1008-0104(2017)06-0069-02

2017-03-15)