β-C對急性胰腺炎大鼠血清上皮型鈣黏素E水平變化的影響①

卓 越，宋君杰，田 樺，張雪梅，程 開，武榮國

(佳木斯大學附屬第一醫院消化科，黑龍江 佳木斯 154003)

β-C對急性胰腺炎大鼠血清上皮型鈣黏素E水平變化的影響①

卓 越，宋君杰，田 樺，張雪梅，程 開，武榮國

(佳木斯大學附屬第一醫院消化科，黑龍江 佳木斯 154003)

目的：觀察β-胡蘿卜素(β- Carotenoids，β-C)對急性胰腺炎(Acute pancreatitis，AP)模型大鼠血清中上皮型鈣黏素E蛋白(E-cadherin ，E-cad)水平的影響。方法：成年Wistar大鼠45只(體重：200～250g)，隨機分為3組: A組,急性壞死性胰腺炎非處理組(n=15)；B組, β-C處理組(n=15)；C組,假手術組(n=15)。造模前7d開始對各組動物進行干預:其中，B組大鼠每日給予無菌大豆油稀釋的β-C油劑(濃度為10mg/ml,以 40mg/kg.d 劑量)灌胃一次；A、C兩組以等劑量大豆油代替。各組自由飲用食水，但飼料中均不含有維生素A(vitamin A),術前12h禁食水。采用Aho方法建立ANP大鼠模型,測定各組1h、3h、6h的血清淀粉酶(Serum amylase，AMS)及E-cad蛋白濃度。結果：A、B組血清AMS水平較C組顯著升高，差異具有統計學意義。A、B組大鼠血清E-cad蛋白水平明顯高于C組；并且，β-C處理組大鼠血清E-cad蛋白水平較A組顯著降低，差異均具有統計學意義。結論：急性胰腺炎大鼠血清中E-cad濃度顯著升高,經β-C干預可以有效降低血清E-cad水平，提示β-C可能通過穩定細胞骨架結構減清AP時的胰腺細胞損傷。

β-胡羅卜素；急性胰腺炎；上皮型鈣黏素E蛋白；酶聯免疫法

急性胰腺炎(Acutepancreatitis，AP)發生時，胰腺細胞出現的分泌、轉運、胞吐等生物學功能紊亂與細胞骨架受損密切相關[1]。肌動蛋白微絲(Actin Filaments，F-actin)是細胞骨架的重要組成部分，E-cad的胞內區通過連接素(catenins)與F-actin相連[2]。AP時F-actin解聚普遍存在，導致胰腺細胞骨架結構受損，勢必引起血清E-cad水平的改變。本研究旨在通過觀測β-C對AP大鼠血清E-cad水平變化的影響，初步探究β-C在AP過程中對大鼠胰腺細胞骨架結構的保護作用。

1 材料與方法

1.1 材料和儀器

雄性Wistar大鼠45只 (體重200 ～250g,購于大連醫科大學動物實驗中心)；20%天然β-C油劑(購于武漢星辰現代生物工程有限公司)、牛磺膽酸鈉(Sigma 公司)；淀粉酶(AMS)檢測盒 (購于上海復興長征醫學科學有限公司)；大鼠上皮型鈣黏蛋白(E-Cad)酶聯免疫吸附測定試劑盒(德國，購于上海江萊科技有限公司)；10%水合氯醛, 75%乙醇(由佳木斯大學動物實驗中心提供)；Heidolph DIAX600勻漿器(德國)；顯微手術器械 (上海)；J -35型離心機(美國)；7220分光光度儀(上海)；811自動生化分析儀(日立公司) 。

1.2 實驗方法

1.2.1 動物分組及飼養:健康成年雄性Wistar大鼠54只, 隨機分為3組：急性壞死性胰腺炎(ANP)非處理組(A組)；β-C處理組(B組)；假手術組( C組)。其中，B組大鼠于實驗前給予無菌大豆油稀釋的β-C油劑(濃度為10mg/mL)，以40mg·kg-1·d-1劑量每日灌胃1次, 連續7d ；A、C組以等劑量無菌大豆油替代。各組術前自由飲用食水, 但飼料中均不含有Vitamin A , 于術前12h禁食水 。

1.2.2 建立模型:誘導ANP:麻醉大鼠后剖腹,在手術顯微鏡下進行牛磺膽酸鈉膽胰管逆行注射(5%牛磺膽酸鈉0.1mL/100g，注射速度0.1mL/min)[3]。假手術組僅翻動胰腺。各組動物分別在1、3、6h處死(每時點n=5)取腹主動脈血, 離心(3500r/min 、15min 、4℃) , 取上清保存于-40℃待測AMS及E-Cad蛋白濃度。

1.3 統計學方法

2 結果

A、B組血清AMS水平較C組顯著升高，差異具有統計學意義,提示ANP造模成功，見表1。A、B組大鼠血清E-cad蛋白水平明顯高于C組；并且，β-C處理組大鼠血清E-cad蛋白水平較對照組顯著降低，差異均具有統計學意義，見表2。

表1 三組AMS水平的比較

*P<0.05,組間差異具有統計學意義。

表2 三組E-cad水平的比較

*P<0.05,組間差異具有統計學意義。

3 討論

上皮型鈣黏蛋白E(E-cadherin，E-cad)是I型鈣黏素超家族中的單鏈跨膜糖蛋白分子，其基因定位于人體的第16號染色體上(即CDHI：16q22.1，含16個外顯子,15個內含子,全長4.8kb)，表達于大多數上皮細胞的膜表面，在調節胚胎形態發育、確保上皮細胞間有序緊密的連接和維持細胞膜結構的完整與極性等方面發揮著至關重要的作用。

E-cad在結構上可分為細胞外區(由一個信號肽與一個細胞外段構成)，跨膜區以及細胞質區。其中，胞內段通過連環蛋白與細胞骨架相連接；跨膜區由32個氨基酸組成，主要起到“膜錨定”作用；胞外區由5個重復串聯的單元結構組成，是E-cad的主要功能區域。同種上皮細胞依賴E-cad胞外區內第一個重復序列中的His-Ala-Val序列結構域之間的相互作用，以實現彼此之間的有效黏附，在特定條件下(如AP時引起的胰腺細胞骨架受損[4]),胞外區可以被多種蛋白酶所降解，形成80kd左右的片斷而釋放入血,即為血清可溶性E-cad(sE-cadherin，sE-cad)。

業已證實，E-cad功能失活的機制主要包括編碼基因的突變、等位基因缺失、基因啟動子的超甲基化、以及基因表達調控的異常，其數量的減少或缺失與許多惡性腫瘤的分化及侵襲能力密切相關。E-cad表達的下調，使腫瘤細胞喪失接觸抑制而無限增殖,失去分化；細胞連接松散,擴散和轉移的能力增強。較早的研究表明，sE-Cad在全身炎癥反應綜合征(Systemic inflammatory response syndrome，SIRS)患者中顯著升高，并與疾病的嚴重程度相關[5]。在SAP導致的SIRS反應中，機體內多種蛋白酶被激活，包括基質金屬蛋白酶(Matrix metalloproteinases，MMPs)、激肽釋放酶7、 纖溶酶和胰蛋白酶等[6]，它們作用于胰腺細胞膜E-Cad細胞外肽段，導致血清sE-Cad濃度升高，其中MMPs的作用最為顯著。陳海川[7]等研究顯示，SAP患者血清中的sE-cad水平較MAP和其他腹部炎癥患者顯著升高，并證實sE-cad的高濃度與疾病的嚴重程度相關。

本研究顯示，A、B組E-cad濃度較C組顯著升高，與臨床研究結果相同[8]。同時，在本研究中通過使用β-C對大鼠進行保護性預處理，發現其可以有效的降低AP大鼠血清中E-cad的濃度。

β-胡蘿卜素(β- Carotenoids，β-C)是體內維生素A主要的生成來源，發揮重要的生物學功效，而且已被廣泛的應用于維生素A缺乏癥、夜盲、心血管病、皮膚角化等疾病的預防及治療。研究發現，β-C在清除氧自由基、猝滅單線態氧和抗脂質過氧化等生理過程中依然發揮了重要作用，是抗腫瘤、增強機體免疫、抗氧化[8]等方面重要的研究目標。較早的研究已表明[9]，β-C可以通過緩解脂質過氧化減輕AP時的細胞受損；而此次研究的結果還顯示，β-C可能在維持大鼠ANP時胰腺細胞骨架穩定性方面發揮重要作用。

綜上所述，β-C可以有效降低ANP大鼠血清中E-cad的水平，提示β-C可能通過穩定細胞骨架結構以減輕AP時的胰腺細胞損傷，但確切的機制尚待進一步研究。

[1]Jungermann J，Lereh MM，Weidenbach H，et al.Disassembly of the rat pancreatic acinar cytoskeleton during supramaximal secretagogue stimulation[J]. Am J Physiol，1995，268：328-338

[2]Neneill H，Ozawa W，Kemler，et al.Novel function of the cell adhesion molecule uvomorulin as an inducer of cell surface polarity [J].Cell，1990，62：309-315

[3]Aho H J , Koskensalo S M, Neralainen T J .Experimental pancreatitis in the rat: Sodium taurocholate -induced acute haemorrhagic pancreatitis[J]. Scand J Gastroenterol,1980,15(4):411

[4]Schmitt MD，Konowski PHD，Eekert M，et al. Disruption of paracellular sealing is an early event in acute caerulein-Pancreatitis[J].Pancreas，2004，28(2) ：181-190

[5]Pittard AJ, Banks RE, Galley HF, et al. Soluble E-cadherin oncentrations in patients with systemic inflammatory response syndrome and multiorgan dysfunction syndrome[J]. Brit J Anaesth, 1996, 76(5):629-631

[6]Johnson SK, Ramani VC, Hennings L, et al. Kallikrein 7 enhances pancreatic cancer cell invasion by shedding E-cadherin[J]. Cancer, 2007, 109(9): 1811-1820

[7]陳海川，徐雪琴，俞海波. E-Cadherin在急性胰腺炎中的檢測及其意義[J].肝膽胰外科雜志，2013，25(6):471-473

[8]王夢亮，楊依廉，郭小青等.硒化類胡蘿卜素抗氧化作用的研究[J].藥物生物技術，1998，15(5) ：109-111

[9]田樺，王燁，卓越等. β-C在急性出血壞死性胰腺炎中對GSH及MDA的影響[J].黑龍江醫藥科學，2007，30(3):11

1.黑龍江省自然科學基金面上項目，編號：H2015072；2.黑龍江省教育廳科技項目，編號：12531695。

卓越 (1964～)男，黑龍江佳木斯人，碩士，教授，主任醫師，碩士研究生導師。

宋君杰(1988～)男，黑龍江佳木斯人，在讀碩士研究生。E-mail:158286030@qq.com。

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1008-0104(2017)06-0088-02

2017-09-12)