Wnt/β-catenin信號調控對海馬區Aβ1-42誘導的神經干細胞損傷的影響①

盛寶英，姜堯佳，李 瑩，任秀敏，教 偉，王增冕，田嘉瑩，吳佳歡，王 杰

(1.佳木斯大學附屬第一醫院神經內科，黑龍江 佳木斯 154003；2.佳木斯市中心醫院，黑龍江 佳木斯 154002)

Wnt/β-catenin信號調控對海馬區Aβ1-42誘導的神經干細胞損傷的影響①

盛寶英1，姜堯佳1，李 瑩1，任秀敏1，教 偉1，王增冕1，田嘉瑩1，吳佳歡1，王 杰2

(1.佳木斯大學附屬第一醫院神經內科，黑龍江 佳木斯 154003；2.佳木斯市中心醫院，黑龍江 佳木斯 154002)

目的：通過調控Wnt/β-catenin信號的表達以觀察其對β淀粉樣蛋白所誘導的海馬區神經干細胞損傷的影響。方法：通過Aβ1-42注射大鼠海馬區誘導神經干細胞損傷，實驗組同時注射Wnt3a激動Wnt/β-catenin信號表達，于5周后評價各組間認知功能水平并采用免疫組織化學法檢測各組間BrdU陽性細胞數。結果：Aβ1-42可致海馬區神經干細胞增殖水平降低，損傷后引起明顯認知功能障礙；Wnt/β-catenin信號激動可減輕Aβ1-42所誘導的神經干細胞損傷，促進神經干細胞增殖，并可改善認知功能。結論：Wnt/β-catenin信號上調可促進內源性NSCs的增殖分化，是治療阿爾茨海默病的途徑之一。

阿爾茨海默病；神經干細胞；Wnt/β-catenin；Aβ1-42；BrdU；增殖

海馬區神經細胞凋亡是引起阿爾茨海默病(Alzheimer’s disease,AD)的重要機制之一[1]。目前，AD的發病機制與病因仍處進一步研究之中，為大多學者所公認的重要機制之一是由于各種原因引起的β-淀粉樣蛋白(Aβ)代謝發生障礙而過度累積于腦組織中， 不僅引起膠質細胞的過度增生，而且進一步使Aβ相關的免疫級聯反應得到觸發，進而造成神經元凋亡[2]。有研究顯示，Wnt/β-catenin信號的激活可以促進成體動物神經干細胞(Neural stem cells，NSCs)的增殖及向神經元分化[3]。因此，本研究利用Wnt/β-catenin信號激動劑Wnt3a調控Wnt/β-catenin表達，對比由Aβ1-42所誘導的海馬區神經干細胞損傷大鼠認知能力及內源性神經干細胞增殖水平的變化，探討AD的治療方法。

1 材料和方法

1.1 材料

清潔級成年雄性Wistar大鼠40只，體重220～250g(佳木斯大學實驗動物中心)；Y型電迷宮(張家港生物醫學儀器廠)；恒溫培養箱(Sanyo公司)；立體定向儀(上海光電儀器廠)；垂直電泳槽(北京六一儀器廠)；轉膜儀(德國GE公司)；小鼠抗大鼠BrdU(Sigma公司)；Aβ1-42(Sigma公司)；Wnt3a(Peprotech公司)；SABC試劑盒及DAB顯色液(博士德公司)；β-Catenin抗體及其磷酸化抗體(Abcam公司)。

1.2 方法

1.2.1 AD造模[4]:與實驗分組 40只大鼠隨機分為對照組10只、AD組15只及實驗組15只。其中對照組僅行麻醉，AD組及實驗組行AD造模。10%水合氯醛以0.2mL/kg為標準注射入大鼠腹腔進行麻醉；大鼠頭部固定于立體定位儀進行海馬定位[5]；術區備皮、消毒后行顱骨開孔；微量加樣器垂直大腦表面刺入3.0mm，5μL聚態Aβ1-42以1μL /min速度注入，留針10min保證懸液彌散后撤針行切口縫合。造模后分籠飼養并連續5d給予青霉素腹腔注射3萬U/kg，1次/d。7d后于Y型電迷宮測試大鼠行為學改變，以學習和認知能力下降為AD造模成功標準。其后，實驗組海馬組織注入Wnt3a蛋白(100mmol/L)5μL，另以5μL生理鹽水注射入AD組海馬區。

1.2.2 行為學評定[6]:各組大鼠于術后5周分別進行Y型電迷宮測試行為學改變，評定3次結果取均值。

1.2.3 標本采集與實驗:腹腔麻醉大鼠后心臟灌注PBS及8 %多聚甲醛處死，斷頭取腦于光鏡下切取海馬區組織。-80℃冷凍每例部分海馬組織樣本，采用Western-blot法檢測β-Catenin蛋白表達情況，以GAPDH為內參照，使用Visionworks 6.3.3軟件對圖像灰度值進行比較分析；部分海馬組織樣本脫水、石蠟包埋后切片(5μm)，進行BrdU(5-溴脫氧尿嘧啶核苷)免疫組化染色，隨機選取400倍光鏡下不交疊視野，計數BrdU陽性細胞(細胞內棕褐色染色顆粒)，取4個視野均數進行比較分析。

1.3 統計學方法

2 結果

2.1 行為學測試結果

各組大鼠實驗前學習與記憶能力無明顯差異(P>0.05)。術后5周各組間差異明顯，AD模型組大鼠評測顯示其學習與記憶能力同對照組比較顯著降低(P<0.01)；實驗組大鼠學習與記憶能力同對照組比較明顯降低(P<0.05)；實驗組大鼠學習與記憶能力明顯高于AD模型組(P<0.05)，見表1。

表1 各組大鼠行為學測試結果

注：*、#、△為各組間比較，△、#P<0.05，*P<0.01。

2.2 大鼠海馬組織中β-Catenin檢測結果

圖1顯示Western blot檢測各組大鼠海馬組織中β-Catenin蛋白電泳條帶結果。AD模型組β-Catenin蛋白條帶與對照組比較可見β-Catenin蛋白表達減少，其顏色變淺且條帶變細；實驗組與對照組及AD模型組比較顯示，實驗組β-Catenin蛋白條帶顏色深且條帶寬，說明β-Catenin蛋白表達增多。

圖1 β-Catenin的免疫蛋白印記

圖2顯示光密度值分析結果。AD模型組與對照組比較統計學差異明顯(P<0.05)，其β-Catenin相對光密度值明顯降低，表明Aβ1-42引起大鼠海馬組織中β-Catenin表達下調；實驗組與AD模型組比較統計學差異顯著(P<0.01)，其β-Catenin相對光密度值顯著增加，表明Wnt3a使AD大鼠海馬組織中β-Catenin表達上調；實驗組與對照組間比較(P<0.05)，也表明Wnt3a上調了β-Catenin的表達。

圖2 β-Catenin在海馬組織中的表達變化

(注：*、#、△為各組間比較，*、#P<0.05，△P<0.01。)

2.3 免疫組織化學染色觀察BrdU陽性細胞在大鼠海馬組織的表達

在細胞增殖周期S期BrdU被攝入細胞內，因此海馬組織中的BrdU染色細胞可以被定義為增殖期的神經干細胞。圖3免疫組化染色顯示，實驗組BrdU陽性細胞數較AD模型組及對照組均明顯增加(P< 0.05)，說明WNT3a通過激活β-Catenin蛋白的表達促進NSCs的增殖分化；AD模型組與對照組比較，BrdU陽性細胞顯著減少(P< 0.05)，提示Aβ1-42通過抑制Wnt/β-catenin信號的表達而抑制NSCs的增殖分化，見表2。

表2 各組大鼠海馬組織BrdU陽性細胞計數結果

注：*、#、△為各組間比較，*、#P<0.05，△P<0.01。

圖3 各組大鼠海馬組織BrdU染色結果(×400)

3 討論

關于AD發病機制的研究中，目前廣為接受的是“β淀粉樣蛋白學說”[2]。研究表明，Aβ作為極強的神經毒性物質，其代謝發生異常而致大量累積于神經系統，可能是AD發生和發展的始動因素[7]。并且近年有相關研究表明，在由Aβ所介導的神經元損傷進程中，Wnt/β-catenin信號通路可能具有重要作用[8]。

Wnt基因自被發現以來，目前在哺乳動物體內共發現19種Wnt 基因亞型。在多種Wnt亞型中，Wnt3a是影響神經干細胞分化的重要亞型，其參與經典的Wnt信號傳導通路(Wnt/β-catenin通路)[9]。研究表明，在無活化Wnt信號的正常細胞質中，β-catenin是以磷酸化的降解復合物形式存在[10]，并最終被蛋白酶體降解，因此在正常細胞中僅存在很低水平的游離狀態β-Catenin[11]。當Wnt通路活化時，可以抑制磷酸化的β-catenin降解復合物形成，從而提高細胞質中游離狀態的β-catenin水平，并進而轉運到細胞核中與特定的靶基因結合，進一步啟動靶基因的轉錄[12]。研究發現，大鼠NSCs被Wnt3a質粒轉染后，Wnt3a在NSCs獲得表達，可使NSCs向神經細胞分化增多[13]。

但以往研究集中于離體狀態下NSCs的培養與增殖調控，以及移植NSCs對AD的作用，對于內源性NSCs增殖調控及其對AD的影響方面的研究相對較少。通過本研究表明，Aβ1-42損傷海馬區所誘導的AD大鼠模型與正常大鼠比較，其β-Catenin蛋白表達顯著降低(P<0.05)，而經Wnt3a對抗后可顯著上調β-Catenin蛋白的表達(P<0.01)；同時，β-Catenin蛋白表達增高后，海馬組織中NSCs增殖分化顯著增多(與對照組比較P<0.05，與AD組比較P<0.01)；此外，經Wnt3a對抗后，實驗組大鼠學習記憶等行為能力顯著優于AD組(P<0.05)。綜合以上結果，進一步證實Aβ1-42可以抑制Wnt/β-catenin信號通路的激活，并且可能是Aβ致AD的發病機制之一；激活Wnt/β-catenin信號通路可以增強內源性NSCs的增殖分化，并且可以拮抗Aβ1-42誘導的神經細胞損傷、促進神經功能修復，是治療AD的可進一步探索研究方法之一。

[1]Bertoni-Freddari C, Fattoretti P, Casoli T, et al. Neuronal Apoptosis in Alzheimer's Disease: The Role of Age-Related Mitochondrial Metabolic Competence[J]. Annals of the New York Academy of Sciences,2009, 1171:18-24

[2]Hardy J, Selkoe D J. The amyloid hypothesis of Alzheimer's disease: progress and problems on the road to therapeutics[J]. Science, 2002, 297(5580):353-356

[3]Nusse R.Wnt signaling and stem cell control[J].Cell Res,2008,18(5):523-527

[4]鄭衍芳, 呂文昌, 孫田靜,等. 蟲草素在Aβ1-42寡聚體誘導AD模型大鼠神經元損傷中的作用[J]. 黑龍江醫藥科學, 2015, 38(3):8-10

[5]帕克森諾斯. 大鼠腦立體定位圖譜[M].北京：人民衛生出版社, 2005

[6]朱秋雙, 任春清, 包利澤,等. 何首烏對阿爾茨海默病大鼠學習記憶能力的作用[J]. 黑龍江醫藥科學, 2011, 34(3):8-9

[7]Alan Poling, Kineta Morgan-Paisley, John J Panos, et al. Oligomers of the amyloid-β protein disrupt working memory: Confirmation with two behavioral procedures[J]. Behavioural Brain Research, 2008, 193(2):230-234

[8]Inestrosa N C, Toledo E M. The role of Wnt signaling in neuronal dysfunction in Alzheimer's Disease[J]. Molecular Neurodegeneration, 2008, 9(1):1-13

[9]Dai C, Stolz D B, Kiss L P, et al. Wnt/beta-catenin signaling promotes podocyte dysfunction and albuminuria[J]. Journal of the American Society of Nephrology Jasn, 2009, 20(9):1997-2008

[10]Cappuccio I, Calderone A, Busceti C L, et al. Induction of Dickkopf-1, a negative modulator of the Wnt pathway, is required for the development of ischemic neuronal death[J]. Journal of Neuroscience the Official Journal of the Society for Neuroscience, 2005, 25(10):2647-2657

[11]Clevers H. Wnt/beta-catenin signaling in development and disease[J]. Cell, 2006, 127(3):469-480

[12]Kléber M, Sommer L. Neural crest stem cell maintenance by combinatorial Wnt and BMP signaling[J]. Journal of Cell Biology, 2005, 169(2):309-320

[13]Muroyama Y, Fujihara M, Ikeya M, et al. Wnt signaling plays an essential role in neuronal specification of the dorsal spinal cord[J]. Genes & Development, 2002, 16(16):548-553

黑龍江省教育廳科學技術研究項目，編號：12531698。

盛寶英(1964～)女，黑龍江佳木斯人，碩士，教授，碩士研究生導師。

姜堯佳(1976～)男，黑龍江佳木斯人，碩士，副主任醫師。E-mail：jyj761024@163.com。

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1008-0104(2017)06-0101-03

2017-06-13)