ALK2基因敲除小鼠的飼養繁育與基因型鑒定①

高旭廣,張 雪,劉麒麟,鄭 嶸,孫宏晨,吳立鵬

(1.佳木斯大學口腔醫學院正畸科，黑龍江 佳木斯 154002;2.吉林大學口腔醫學院病理科,吉林 長春 130000)

ALK2基因敲除小鼠的飼養繁育與基因型鑒定①

高旭廣1,張 雪2,劉麒麟2,鄭 嶸1,孫宏晨2,吳立鵬1

(1.佳木斯大學口腔醫學院正畸科，黑龍江 佳木斯 154002;2.吉林大學口腔醫學院病理科,吉林 長春 130000)

目的：為了繁育和鑒定體內ALK2基因被敲除的小鼠，特將從美國引進的ALK2基因敲除小鼠進行飼養繁育，繼續保種；以及初步探究激活素受體樣激酶2( Alk2)功能缺陷對出生后小鼠在生存能力、繁殖能力、主要組織器官的生長狀態等方面的影響。方法：首先用Cre-loxp重組酶系統培育出ALK2條件基因敲除小鼠， 通過基因型鑒定篩選出實驗組(基因型：Osx-Cre；Alk2fx/fx)和對照組(基因型：Osx-Cre；Alk2fx/+)。結果：成功飼養和繁殖出從美國引進的小鼠，并成功從中篩選出ALK2基因敲除小鼠。結論：采用正確的飼養、繁殖及基因鑒定方法對篩選出基因敲除小鼠及繼續保種意義重大；初步探究小鼠ALK2基因敲除后小鼠的變化為進一步深入研究小鼠的組織器官的生長發育方面的變化及機理奠定了基礎。

ALK2; 條件基因敲除; PCR; 繁殖

在過去幾十年里，學者們利用cre/loxp系統對ALK2在小鼠體內的表達做了具體研究，這使人們越來越了解ALK2的功能，構建出條件基因敲除的小鼠模型。ALK2作為BMPs的膜蛋白受體，具有以下特點：(1)廣泛表達于機體 各個部位及機體發育的各個時期。(2)具有功能特異性，ALK2在不同組織的作用也不同，甚至在同種細胞的不同階段也發揮著不同的作用，可以和多種BMP結合，不同的結合方式發揮著不同作用。因此，采用正確的方法對引進的小鼠進行飼養、繁育及篩選出ALK2基因敲除小鼠，對進一步深入研究ALK2基因被敲除對小鼠的生長發育變化的影響及其變化機理是非常重要的[1,2]。

1 材料和方法

1.1 材料

美國密歇根大學于吉教授惠贈的3只體內含有Osterix-cre酶的雌性小鼠和3只體內含有Alk2fx/+的雄性小鼠。該小鼠的遺傳背景為C57BL/6。

1.2 方法

1.2.1 小鼠的飼養和繁殖

嚴格按照SPF級動物飼養標準對引進小鼠進行飼養，飼養于吉林大學實驗動物中心。屏障環境內的溫度控制在19.5～25.5℃，濕度控制在42%～72%，光照周期：12h/12h[3]。小鼠的飼料墊料及飲水均經過高溫高壓滅菌處理，對小鼠實行自由采食和自由飲水，對配種的小鼠定期給予滅菌后的葵花籽和蛋黃進行營養補充，小鼠所用墊料每周更換兩次。由于從美國引進的種鼠的數量較少，在飼養繁育的初期，我們采用一只雌鼠和一只雄鼠同居交配繁育的方式進行繁殖[4]。

1.2.2 小鼠的基因型鑒定1.2.2.1 提取組織DNA[5]

首先，將實驗所需的小剪刀、鑷子、離心管、槍頭等一系列器械進行高壓滅菌。取材時操作者戴用無菌手套、口罩，于新生小鼠出生第3～5天時，將小鼠尾端組織剪斷置于離心管中，并標記。每個離心管中各加入300μL 1×lysis buffer，置于100℃沸水中煮10min。冷卻至室溫后，將每個離心管中各加入5μL的蛋白酶K，并將離心管置于55℃恒溫的水浴箱中過夜。第2日早晨，離心管從水浴鍋中取出后將其放在100℃沸水中煮10min，然后將離心管轉移到心機中離心20min(33000r/min)[6]。

表1 PCR擴增

注：反應條件為：94℃×5min，1 cycle；92℃°C×30s，65℃×30s，72℃×60s，40 cycles；72°×5min，1 cycle。

1.2.2.2 瓊脂糖凝膠電泳

首先，用電子天平稱取0.6g瓊脂糖，將其加入盛有20mL電泳緩沖液的錐形瓶中，輕輕搖動，將其混勻后用海綿蓋封蓋，然后將封好的錐形瓶放入微波爐中用低火加熱3min，至錐形瓶中的瓊脂糖完全溶解于緩沖液中。其次，從微波爐取出后，快速加入2μLEB，水平搖勻，防止有氣泡產生。將搖勻的瓊脂糖溶液緩慢均勻的倒入膠板中，并將梳子插入膠板中，水平靜置30min，待其凝固。然后輕輕從膠板中拔起梳子，將膠板放入裝有適量電泳液的電泳槽中，以備加樣之用。最后，將加好樣品的含3%瓊脂糖的膠板在電泳槽中電泳(120V，50min)，然后置入凝膠成像儀中進行成像保存，觀察電泳條帶。

表2 酶切酶切體系體積

首先將引物及PCR產物等置于EP管中混勻，然后將EP管置于37℃的恒溫水浴鍋中加熱1h。其次，將EP管取出后，將其按順序加入到含有3%瓊脂糖的膠板中進行電泳(120 V，50 min)。再次，用溴化乙啶染色。最后，將電泳及染色后的膠板放入凝膠成像儀中成像保存，觀察電泳條帶[7]。依照特定的基因條帶對各個小鼠的基因型進行鑒定。見圖1。

1.2.3 繁育與純合子篩選

采用孟德爾經典遺傳學進行育種，并結合 PCR 技術對小鼠進行繁育及基因型確定，進而從中篩選出ALK2基因敲除小鼠。 將用于建系保種繁育的原代(G0)小鼠進行配種繁殖以產生所需的后代。將出生 5d后的仔鼠行PCR 檢測，從中篩選出目標小鼠。

1．3 統計學方法

采用 Fisher 確切概率法檢測ALK2基因敲出對子代小鼠性別的影響并統計分析。P<0．05為差異有統計學意義。

2 結果

2．1 小鼠的繁殖情況

從美國引進的種鼠成功繁殖出子代幼鼠。 每只母鼠孕期為19～21d， 哺乳期為18～23d。 每胎平均產 6～12 只幼鼠，成活率>94%。

2．2 小鼠的生長情況

幼鼠采用母鼠的母乳進行喂養，哺乳期約21d，產后3周左右離乳。 對照組小鼠在形態上大于實驗組。見圖5。

2．3 ALK2基因敲除小鼠繁育結果

選取雌性基因型為Osx-Cre；ALK2fx/+和雄性基因型為ALK2fx/fx成年小鼠合籠配對，新生小鼠中Osx-Cre；ALK2fx/fx基因型為實驗組，Osx-Cre；ALK2fx/+為對照組。

圖1 ALK2基因敲除小鼠模型選定

2．4 小鼠基因型鑒定結果

將出生5d的同一窩的九只小鼠進行編號， 取小鼠組織進行PCR擴增，經鑒定基因型分別為： cre+-flox++：9號小鼠； cre+-flox+-：4號和8號小鼠； flox++：1號，2號，5號小鼠； flox+-： 3號，6號，7號小鼠。見圖2～4。

圖2 小鼠基因型測定(Cre電泳結果)

圖3 小鼠基因型測定(Flox電泳結果)

圖4 小鼠基因型測定(Bgli酶切結果)

圖5 實驗組和對照組小鼠體型對比

3 討論

ALK2作為BMPs的膜蛋白受體，廣泛表達于機體各個部位及機體發育的各個時期，對機體有重要影響。基因敲除技術的方法隨著不斷的發展，從較早期的同源重組技術到近些年的CRISP/Cas9技術不斷的更新發展[8]。本實驗中，運用基因敲除技術，通過Cre/loxp系統使小鼠體內的特定的ALK2基因被敲除，從而使小鼠在生長發育中表現出相關性狀。采用Cre-loxp基因敲除系統對小鼠的特定基因進行敲除或使其缺失，進而研究ALK2基因的結構、功能及相關疾病。為了探討 ALK2基因在小鼠的生長發育中的一系列作用，本實驗特從美國密歇根大學于吉教授處引進三只體內含cre酶的雌性小鼠和三只體內含有Alk2 fx/+ 的雄性小鼠。將此體內含有 Osterix-cre 酶的雌性小鼠和體內含有Alk2 fx/+的雄性小鼠各 1 只共 3 籠進行合籠交配繁殖，其子代中選取基因型為cre+-flox++的做為實驗組，選取基因型為cre+-flox+-的做為對照組。本實驗中采用 PCR 技術對培育的新生小鼠進行相關基因型鑒定 ，進而從新生小鼠中篩選出ALK2基因敲除小鼠，為深入研究ALK2基因在小鼠的生長發育中的作用，以及對不同器官組織細胞的作用機理的研究奠定了基礎。

[1]Lounev, Michael N，Maidment, et al. Identification of progenitor cells that contribute to heterotopic skeletogenesis[J].J Bone Joint Surg Am,2009,91(3):652-663

[2]Celia L Gregson, Sarah A Hardcastle, Cyrus Cooper, et al. Friend or foe: high bone mineral density on routine bone density scanning, a review of causes and management[J].Rheumatology (Oxford),2013,52(6):968-998

[3]橋錄新，徐萌，柴夢音，等.P53基因敲除小鼠的飼養繁殖及鑒定[J].實驗動物科學，2012，23(1)：3

[4]張寶，魏曙光，張洪波，等. DRD3基因敲除鼠飼養繁殖及基因型鑒定[J].安徽農業科學，2013，10(6)：2

[5] 鮑毅新,孫波,張龍龍,等.對動物組織DNA提取方法的改進及PCR檢測[J].浙江師范大學學報(自然科學版)， 2009，32(3)：9

[6]呂學冼，呂仁杰，呂超，等?；蚯贸c基因沉默[J].黑龍江醫藥科學，2009，32(5)：65

[7]張淑紅，宋偉夫，劉艷玲，等.法醫DNA檢驗中快速復合擴增體系的建立[J].黑龍江醫藥科學,2005,28(4)：58

[8]Shalem O,Sanjana NE,Zhang F,et al.High-throughput functional genomics using CRISPR-Cas9[J]. Nature Reviews Genetics,2015,25(7):1030-1042

Breeding,reproducingandtypeidentificationforALK2geneknock-outmice

GAOXu-guang1，ZHANGXue2,LIUQi-lin2，ZHENGRong1，SUNHong-chen2，WULi-peng1

(1.Oral Medicine, Stomatological School of Jiamusi University,Jiamusi 154007,China;2.Oral pathology, Stomatological School of Jilin University,Changchun 130000,China)

ObjectiveBreeding,reproducing, and type identification for ALK2 gene knock-out mice were to preliminary discuss the effect of activated receptor kinase 2 (Alk2) defection to survival, reproduction, influence to the growth of tissues and organs.MethodCre-loxp recombination enzyme system was used to breed ALK2 conditional knockout mice. The mice were divided into experimental group (genotype:Osx-Cre; Alk2fx/fx) and control group (genotype: Osx-Cre; Alk2fx/+) at random.ResultsThe mice imported from the United States were raised and reproduced. ALK2 gene knock-out mice were screened successfully.ConclusionThe proper breeding, reproducing and genetic identification methods are important for screening gene knock-out mice and the preservation of genes; Preliminary investigation into the changes of ALK2 gene knockout mice had laid the foundation for further study on the changes and mechanism of the growth and development of tissue organs.

ALK2; conditional knockout; PCR; breeding

1.國家自然科學基金項目，編號：81500820；2.教育部基金項目，編號：20120061130010。

高旭廣(1989～)男，黑龍江綏化人，在讀碩士研究生，醫師。

吳立鵬(1963～)男，黑龍江富錦人，學士，主任醫師，教授，碩士研究生導師 。E-mail：WLPKQ@sina.com 。

Q344.+13

A

1008-0104(2017)06-0003-03

2017-06-14)